干细胞培养技术范文第1篇

【关键词】 角膜缘干细胞；回顾性研究；进展

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4949（2013）06-35-02

干细胞研究被誉为新世纪生物和医学技术领域可能取得革命性突破的项目，20世纪80年代角膜缘干细胞理论确立，在角膜缘干细胞研究中产生了一些新概念，角膜缘干细胞广泛应用于眼表疾病的治疗，角膜缘干细胞研究成为眼科界近年来发展较快的领域之一。本文对近年来在角膜缘干细胞研究方面的新进展进行综述。

1 角膜缘干细胞治疗眼表疾病的机制

角膜缘干细胞是位于角膜缘基底上皮层的特殊细胞。角膜缘干细胞的高增殖潜力在角膜上皮的修复中具有重要作用，角膜缘干细胞为角膜上皮更新和修复之来源，角膜上皮有由周边向中心移动的特性。角膜上皮的更新是通过一种从角膜缘向角膜中央的向心性运动来完成的，上皮再生的源头位于角膜缘，角膜上皮的更新和创伤修复来源于角膜缘基底层的干细胞增生和分化。角膜缘有丰富的Ⅳ型胶原纤维，该纤维仅存在于结膜和角膜缘基底膜，是构成干细胞增生分化局部微环境的重要组成部分。

2 角膜缘干细胞移植

2.1 自体角膜缘干细胞移植： 随着人们对角膜缘及其干细胞研究的进展，实验表明在促进眼表面愈合、减少角膜新生血管长入和假性胬肉形成方面，角膜缘移植明显优于球结膜移植，这进一步证明角膜缘移植的有效性。该手术多是将自体健眼角膜缘部组织片移植到患眼角膜缘部受损区，自体角膜缘上皮移植不仅能为病变区角膜缘提供健康的上皮来源，使角膜恢复正常透明性，而且可为病变区结膜和巩膜组织提供正常的角膜缘干细胞，有效的阻止异常结膜源性组织增生，达到重建正常组织和牢固的角膜上皮层之目的，减少并发症，提高视功能，自体移植不存在免疫排斥，成功率高[1]。

2.2 同种异体角膜缘干细胞移植： 自体角膜缘干细胞移植只对单侧眼表疾病者适用，而对那些双眼眼疾者不适用，角膜缘丰富的血管和淋巴细胞，使角膜缘不再是免疫赦免区，成人角膜HLA-DR抗原主要分布于角膜下及其基质深层，且HLA-DR抗原在角膜移植排斥反应中起主要作用，角膜缘为免疫排斥的高危区域。Tan等[2]在异体角膜缘移植术前术后使用了免疫抑制剂同种异体角膜缘移植获得成功。近年来不断有新的免疫抑制药物出现，免疫排斥仍是异体角膜缘移植面临的最大难题。

2.3 培养角膜缘干细胞移植

2.3.1 自体角膜缘干细胞培养后移植。

近年来，随着角膜缘干细胞培养技术的成熟，将角膜缘干细胞体外培养后异体移植成为另一研究热点。Lindberg等[3]体外培养角膜缘干细胞，并成功地移植到裸鼠皮下，并牢固地粘附在植床上；Pellaegrini等[4]用自体健眼1mm×1mm×1mm角膜缘干细胞组织块经体外培养扩增后，借助软性角膜接触镜的辅助，移植到患眼上，成功地实现了眼表重建。自体角膜缘干细胞培养后移植不仅解决了自体干细胞来源不足的问题，而且避免了同种异体间移植后的排斥反应。被认为是目前最有前途的治疗方法。除此之外，有专家用人羊膜为支架，成功进行了人自体培养的角膜缘干细胞移植，治疗干细胞缺乏的眼表疾病；还有专家行角膜缘干细胞羊膜片移植治疗角膜缘功能障碍。这些研究证实，培养自体角膜缘干细胞移植提供了一种极好的技术来重建眼表，没有排异反应，供体眼角膜缘少量取材，不损伤干细胞群及角膜，细胞体外培养和扩增技术提供供体细胞来源。

2.3.2 异体角膜缘干细胞培养后移植。

潘志强等[5]以人羊膜为载体，分别将原代培养的人角膜缘干细胞接种在羊膜上面，然后把含有干细胞的羊膜片分别移植到化学烧伤或热烧伤后有角膜新生血管形成的人眼角膜上，角膜干细胞羊膜移植术后，移植片在受体植床上能够存在并与巩膜和结膜完全融合为一体，羊膜逐渐被受体组织吸收，角膜透明度增加，基质炎性浸润减轻，上皮光滑，角膜新生血管减少，视力不同程度的提高，这说明移植的角膜干细胞在受体角膜中存活并进行正常增殖和分化形成角膜上皮细胞。临床观察中未发现明显的排斥反应，异体角膜缘干细胞培养后移植目前已取得了一定的效果，它给临床上双眼角膜缘干细胞不同程度功能障碍病人带来曙光。至于植后是否会出现排斥反应等一系列问题都有待于进一步的研究。

4 角膜缘干细胞移植进展与发展趋势

角膜缘干细胞移植已成为目前眼科研究一大热点，随着多学科交叉、现代生物技术的发展，角膜缘干细胞的定位、分离、培养问题已经得到解决，人工角膜的研究已经取得了实质性进展。在国外已有多型人工角膜应用于临床，在治疗难治性角膜病变方面显示出越来越多的优越性。虽然还有相当多的问题亟待解决。一旦培养的角膜干细胞移植术成功，就不仅解决了角膜缘移植材料供应不足的问题，而且用自体组织来源的角膜缘干细胞进行移植可以消除移植排斥反应的发生。可以预见在不久的将来，离体培养的角膜缘干细胞将为那些角膜缘功能衰竭患者带来希望，并且为临床眼用药物筛选提供细胞模型，具有广阔的应用前景。

参考文献

[1]黄胜，张娅萍，丁田等.自体角膜缘干细胞移植治疗角膜缘功能衰竭症[J].眼科新进展，2004.

[2]Tan DT，Ficker LA，Buckley RJ.Limbal transplantation[J].Ophthalmology，1996；103（1）：29-36.

[3]Lindberg K，Brown ME，Chaves HV，Kenyon KR，Rheinwald JG.In vitro propagation of human ocular surface epithelial cells for transplantation[J].Invest ophthalmol Vis sci，1993；34（9）：2672.

干细胞培养技术范文第2篇

据英国媒体报道，英国研究人员首次用3D打印机打印出胚胎干细胞，干细胞鲜活且保有发展为其他类型细胞的能力。我们知道，胚胎干细胞存在于胚胎发育早期的囊胚中，可发育为不同的细胞，是所有细胞最初期的形态。胚胎干细胞是万能的，意味着它们可以发育成为身体内200多种细胞类型中的任何一种。研究人员说，这种技术或可制造人体组织以测试药物，制造器官，乃至直接在人体内打印细胞。

胚胎干细胞3D打印机配备两个“生物墨盒”，一个装着浸在细胞培养基中的人体胚胎干细胞，另一个只有培养基。计算机控制微调阀喷出“墨水”，其速度可通过改变喷口直径实现精确控制。

打印机上有显微镜，可以观察细胞打印情况。两种“墨水”一层一层间隔喷洒，形成不同浓度细胞飞沫，最小飞沫体积仅2纳升，包含大约5个细胞。飞沫被喷入有诸多凹孔的培养皿中，翻转培养皿，飞沫形成悬液，在各凹孔内“抱成团”。打印机可精确控制飞沫大小，使干细胞达到分化的最佳状态。

研究人员在《生物制造》杂志说，检测结果显示，打印24小时后，95%以上细胞仍然存活，打印过程未杀死细胞；打印3天后，超过89%细胞存活，而且仍然维持多能性，即分化出多种细胞组织的潜能。

研究人员已经用3D打印的干细胞制造出骨髓和皮肤。他们认为，最终能借助这种方法制造器官，从而无需器官捐献，同时还可以解决器官移植中的免疫抑制等问题。

干细胞培养技术范文第3篇

[关键词]毛囊干细胞；鉴定；分离培养

[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）19-0077-04

The cultivation and identification of hair follicle stem cells

XIAO Feng1，TAN Jun2

（Department of Plastic and Laser Aesthetic Surgery，People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410000，Hunan，China）

Abstract： Hair follicle stem cells are the ideal seed cells for skin tissue engineering，which has become a hot research topic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author will analyze and summarize several methods of isolation and culture of hair follicle stem cells in recent years.It will provide a solid foundation for the further study of hair follicle stem cells.

Key words：hair follicle stem cells；identification；cultivation

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，存在于胚胎及成体内。在一定条件下，干细胞可以无限增殖而保持未分化状态，也可以分化成多种功能细胞。20世纪，Cotsarelis、Taylor等[1]通过相关研究发现，在毛囊上部由外根鞘形成的明显突起，即隆突区域也有干细胞的存在，这些干细胞被定义为毛囊干细胞。毛囊干细胞与其他成体干细胞一样拥有强大的增殖能力及多向分化潜能[2]。毛囊干细胞能通过自身的分裂增殖产生各种机体所需的细胞，以补充脱落和缺失的细胞；毛囊干细胞不仅能够向下转移到毛囊根部生成毛囊，而且还能从毛囊外根鞘向上迁移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪[3-4]。近年来，毛囊干细胞的研究备受关注，已成为研究热点之一。目前，存在多种毛囊干细胞的分离培养及鉴定方法，为毛囊干细胞的深入研究提供了坚实的基础，作者就毛囊干细胞常用的分离培养及鉴定作一简要综述。

1 毛囊干细胞的分离纯化

此前，已有许多研究者采用不同的方法来分离毛囊干细胞，并成功地进行传代培养，进行后续更深入的研究。目前对毛囊干细胞分离纯化常用的有以下几种方法：

1.1 组织块培养法

取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用PBS液冲洗，将皮肤切成小块，表皮朝上贴于加入适量培养基的培养器皿中，置于5%CO2培养箱中，37℃，饱和湿度条件下培养。组织块培养法分离的干细胞能持续保持增殖趋势，没有明显的平台期，并且随着不断传代纯化，此方法获得的毛囊干细胞纯度明显增加。但是组织块培养法分离获取毛囊干细胞的效率较低。史明艳等[5]使用该方法成功获得毛囊干细胞，并分析指出该方法的优势在于组织块培养时从组织块中迁移出来其他细胞为毛囊干细胞创造了一个类似于体内的微环境，使毛囊干细胞能最大程度地保留增殖分化能力。

1.2 显微分离技术

取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高浓度青、链霉素的PBS液反复冲洗3次；在超净工作台内，显微镜下显微镊钝性分离单个毛囊组织，收集形态完好且处于生长期的毛囊。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入含培养基培养皿，于37℃、5%CO2孵箱中培养。显微分离技术能从样本直接选取毛囊干细胞相对富集区域，有利于后续进一步的纯化[6]。王祝迁等[7]使用此方法成功分离出大鼠毛囊干细胞，但单纯应用显微分离技术获取高纯度的毛囊干细胞需花费大量的时间和精力，效率偏低。

1.3 酶消化法

取含有待培养毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用含双抗PBS液冲洗，将皮肤样本剪成小块，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃摇床消化2h。取出组织用PBS冲洗3遍，置于胰蛋白酶（质量浓度为2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃摇床消化1h后，过200目钢网。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入细胞培养液培养。此方法获得的毛囊干细胞克隆形成能力强，获取效率高。郑宣等[8]用此法获得较纯的毛囊干细胞，但获得的毛囊干细胞经历增殖期后生长速度逐渐减慢，且细胞存活率下降，可能与酶消化法破坏了毛囊干细胞生长微环境有关。

1.4 差数贴壁法

将收集的细胞接种于Ⅳ型胶原包被的培养皿中，静置20min后，收集上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一培养皿中，贴附皿底的毛囊干细胞，置于体积分数为5%CO2、37℃孵箱中培养，每3d换液一次。与单纯使用某种毛囊干细胞分离方法相比较，联合差数贴壁法将更进一步纯化，获得纯度更高的毛囊干细胞。彭等[9]使用酶消化法联合差数贴壁法获得了形态典型且均匀一致的毛囊干细胞。目前此方法已被广泛使用。

1.5 免疫磁珠法

免疫磁珠法主要用来纯化分离培养获得的毛囊隆突区细胞中某种标记物阳性的细胞。首先制作细胞悬液，并加入FITC标记的某种标记物单抗，室温孵育30min，离心后弃上清中未结合的抗体，加入磁珠分选缓冲液重悬细胞，再次离心后弃上清，PBS缓冲液清洗2次，取重悬后细胞与免疫磁珠混合，室温反应30min。磁珠分离器分离8min，去除未与磁珠结合的细胞。将结合了靶细胞的免疫磁珠用磁珠分选缓冲液洗5次。体积分数为5%CO2、37℃孵箱培养48h，使细胞与磁珠分离，即可获得较纯的毛囊干细胞。谭挺等[10]用此法获得高纯度毛囊干细胞，他们指出此方法与显微分离技术连用有单次操作分离细胞数量大且纯度较高、能与细胞培养、流式细胞术、荧光显微镜等分子生物学技术兼容等特点。黄恩毅等[11]用此法有效分离并成功培养CD34+毛囊干细胞，发现分选后的细胞仍具有较好的活性，且增殖速度快，增殖期长。卢葳等[6]通过实验证实，免疫磁珠分选后毛囊干细胞活力较好，分离获得的毛囊干细胞适合用于细胞培养、诱导等后续试验。

1.6 流式细胞仪分选法

通过毛囊干细胞表达的某些特异性标记物，利用流式细胞仪可以将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来，获得较高纯度的特异性细胞。常用的是荧光激活细胞分选器。卢葳等[6]使用流式细胞仪分选CD34+毛囊干细胞，获得的毛囊干细胞纯度很高、污染机会小，但是分选过程费时，细胞分选后活力稍差。此方法适合于需要做免疫组化，蛋白质组织学等对细胞纯度要求高的实验。

2 毛囊干细胞的鉴定

干细胞的鉴定一直是干细胞研究的难点，常用干细胞的标记物辅助方法进行鉴定。毛囊干细胞有多种明确的分子标记物，如CD34、K15、K19 [12]。

2.1 角蛋白家族

角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。在表皮细胞中，它们以微丝的状态在细胞内形成广泛的网状结构。在上皮组织中有20多种不同种类的角蛋白表达。在表皮细胞中，随着分化程度的不同其所表达的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作为毛囊干细胞的鉴定手段。1998年，lyle等[13]通过表达克隆发现K15是毛囊干细胞表面标记之一，此后K15一直被当做较为公认的毛囊干细胞标记物。20世纪末，有研究者通过实验发现滞留细胞所在的毛囊隆突部细强表达K19[14]；同时有实验发现毛囊隆突部K19高表达细胞缺乏特异性分化标志，进一步证实 K19高表达细胞为毛囊干细胞，因此，认为K19也可作为毛囊干细胞表面标记物[15]。在毛囊干细胞分化过程中，K15表达减弱较K19早，K19表达阳性而K15阴性的细胞仍有可能为处于早期阶段的增殖细胞，因此推测，检测毛囊干细胞时K15更准确[13]。

2.2 钙黏蛋白家族

钙黏蛋白是一种同亲型结合、Ca2+依赖的细胞黏着糖蛋白，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有重要作用。不同细胞及发育不同阶段其细胞表面的钙黏蛋白的种类与数量均有所不同，目前已经发现几十种钙黏蛋白。CD34抗原是钙黏蛋白中的一种，是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，为阶段特异性白细胞分化抗原，CD34表达于人类造血干细胞，CD34是目前公认的造血干细胞标志物。Ohyama等[16]通过对鼠毛囊的研究，发现鼠毛囊中CD34阳性细胞与毛囊隆突部滞留细胞和K15阳性细胞在毛囊处位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干细胞标记物。Trempus等[17]通过动物实验首次证实了CD34表达于小鼠毛囊干细胞。但CD34在人毛囊干细胞不表达，Shu Jiang等[18] 通过对人头皮进行原位免疫组化和多色免疫荧光标记，发现CD34特异性表达于毛囊间表皮基底部。

2.3 整合素家族

整合素是机体重要的黏附分子，是广泛存在于动植物细胞表面的一类细胞跨膜蛋白，在细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间起黏附作用，整合素是由α和β两个亚单位组成的异源二聚体，它们按不同的组合构成20余种整合素。目前，整合素也被广泛用于毛囊干细胞的鉴定，常用的整合素为整合素β1。1995年，Jones等[19]根据表皮细胞表达整合素β1的水平将其进行分组培养，结果发现整合素β1高表达的表皮细胞比低表达者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Watt等[20]发现，富含整合素β1的皮肤基底细胞比整合素β1含量少的皮肤基底细胞能更快速的黏附细胞外基质蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述发现均为整合素β1作为毛囊干细胞特异性表面标记物提供有力支持。

3 结论

综上，目前常用的分离培养方法主要包括：组织块培养法、显微分离技术、酶消化法、差数贴壁法、免疫磁珠法、流式细胞仪分选法，每种方法均有各自的优势及缺陷；组织块培养法简单，但是分离纯度不高，分离效率低下；显微分离技术相对其他方法而言，分离纯度高，但是分离过程比较费时费力；酶消化法效率高，但是酶消化过程同时会破坏细胞微环境，影响细胞存活率；差数贴壁法一般联合其他分离纯化方法，能进一步纯化所获毛囊干细胞；免疫磁珠法获得的毛囊干细胞纯度高、活性强，但是分离方法较复杂；流式细胞仪分选法所获得毛囊干细胞纯度高，但细胞活性低。因此，在选择毛囊干细胞分离培养方法时一定要根据实验的特殊要求及实验条件选择合适的方法。毛囊干细胞的鉴定方法常用的包括：角蛋白家族、钙黏蛋白家族、整合素家族；实验条件允许的情况下，同时检测两种以上的标记物来鉴定毛囊干细胞是较为准确的一种方法。

毛囊干细胞具有其他干细胞的共同特征，具有多向分化潜能。目前，已有实验证实毛囊干细胞能用于尿道缺损、神经损伤的修复；能够分化成为脂肪细胞和成骨细胞[1，21-22]；能有效促进创面愈合，将其作为工程皮肤中的种子细胞，有利于表皮细胞及汗腺、毛囊等附属器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干细胞有利于瘢痕的修复，但该研究仍处于起步阶段，相信经过研究者们的不懈努力，其必将为瘢痕治疗这一世界性难题提供一种有效的新方法。

[参考文献]

[1]赵奎，贾宗菲，弓慧敏，等.毛囊干细胞的分离方法及应用[J]. 中国畜牧兽医，2010，37（12）：82-85.

[2]Wu JC，Yang TT，Xu X，et al.Research on differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes invitro[J].J Med Postgra，2010，23（2）：128-132.

[3]原璐，王春生，安铁洙，等.毛囊干细胞研究进展[J].中国生物杂志，2009，29（1）：75-79.

[4]Jaks V，Barker N，Kasper M，et al.Igr5 marks cycling， yet long-lived，hair follicle stem cells[J].Nat Genet，2008，40（11）：1291-1299.

[5]史明艳，杨学义，窦忠英.山羊毛囊干细胞分离培养方法研究[J].畜牧兽医学报，2006，37（5）：436-440.

[6]卢葳，陈瑾，李惠.两种纯化大鼠毛囊干细胞方法的比较[J]. 重庆医科大学学报，2010，35（1）：124-126.

[7]王祝迁，木拉提・热夏提，李佳，等.大鼠触须毛囊干细胞的分离培养和鉴定[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2011，15（27）：5031-5034.

[8]郑宣，许世超，全仁夫.大鼠毛囊干细胞的体外培养及相关检测的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志，2014，22（2）：8-14.

[9]彭，王玉杰，李佳，等.不同体积分数富血小板血浆与大鼠毛囊干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究，2012，16（45）：8501-8505.

[10]谭挺，胡志奇，周洪军.显微分离培养与免疫磁珠法分离纯化人毛囊干细胞[J].中国修复重建外科杂志，2008，22（2）：202-205.

[11]黄恩毅，杨恬，陈伟，等.毛囊干细胞的纯化培养鉴定及其生物学特性[J].第三军医大学学报，2008，30（1）：39-42.

[12]Tsai SY，Clavel C，Kim S，et al.Oct4 and klf4 reprogram dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells[J].Stem Cells，2010，28（2）：221-228.

[13]Lyle S，Christofidou-Solomidou M，Iiu Y，et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the 10- 8 cation of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci，1998，111：3179-3188.

[14]Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro： keratin 19 expressing cells are differentially 10 calized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage[J].J Cell Sci，1996，109：1017-1028.

[15]Reynolds AJ，Jahoda CA.Hair follicle stem cells A distinct germinative epidermal cell population is active in vitro by the presence of hair dermal papillar cells[J].J Cell Sci，1991，99：373-385.

[16]Ohyama M，Terunuma A，Tock CL，et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells[J].J Clin Invest，2006，116（1）：249- 260.

[17]Trempus CS，Morris RJ，Bortner CD，et al.Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34[J].J Invest Dermatol，2003，120（4）：501-511.

[18]Shu Jiang，Longmei Zhao，Bhamini Purandare，et al. Differential expression of stem cell markers in human follicular bulge and interfollicular epidermal compartments[J]. Histochem Cell Biol， 2010，133：455-465.

[19]Jones PH，Harper S，Watt FM. Stem cell patterning and fate in human epidermis[J].Cell，1995，80（1）：83-93.

[20]Watt FM.Epidermal stem cells：markers，patterning and the control of stem cell fate[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，1998，353（1370）：831-837.

[21]蔡霞.人毛囊干细胞的分离培养鉴定与生物学特性的初步研究[J].四川医学，2014，35（1）：1-3.

干细胞培养技术范文第4篇

【关键词】垂体肿瘤转化基因；RNA干扰；胶质瘤；侵袭

【中图分类号】R739.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-0616（2015）21-09-05

脑胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，目前以手术治疗为主，辅以放疗及化疗等综合治疗，但是由于胶质瘤的恶性程度高，呈浸润性生长，与周围正常脑组织无明显分界，易于复发，并随着复发次数的增加其恶性程度也会不断增加。因此，临床疗效仍不理想。目前胶质瘤研究的重要任务是研究与胶质瘤恶性进展相关的基因，为胶质瘤的诊断和治疗寻找新的途径。垂体肿瘤转化基因（PTTG）是1997年，Pei等在大鼠垂体肿瘤组织中发现的，其中PTTG1是在MG63骨肉瘤细胞中被发现能够抑制分离酶的活性，使姐妹染色体分离受阻，增加使细胞突变机率，从而导致肿瘤的发生发展。PTTG1基因在大多数恶性肿瘤及内分泌相关性肿瘤中均有较高表达，目前研究认为PTTG1基因与抑制染色体分离密切相关，还参与了血管生成，在肿瘤的发生发展及侵袭转移中起到重要作用。本课题组在前期研究中已经证实PTTG1在人脑胶质瘤细胞中的表达较正常脑组织明显增强，并与胶质瘤的恶性程度呈正相关。在本研究中我们应用RNA干扰技术，构建高效沉默PTTG1的siRNA干扰质粒，并将其转染入胶质瘤细胞U373中，探讨其对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭性的影响。

1材料与方法

1.1实验材料

胶质瘤细胞株U373（ATCC编号：HTB-17），第5～8代细胞用于做细胞学实验，DMEM培养基，胎牛血清，大肠杆菌DH5α感受态细胞（购于天根生化有限公司），质粒Pgenesil 2（购买于武汉晶赛生物工程技术公司），RT-PCR试剂盒，鼠抗人PTTG1单克隆抗体（购于美国Santa Cruz公司）。

1.2实验方法

1.2.1胶质瘤细胞的培养 胶质瘤细胞株U373用DMEM培养基（含10%胎牛血清）传代培养，培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。细胞生长状态良好时进行实验，转染PTTG1干扰质粒的细胞作为实验组，转染非干扰质粒的细胞作为对照组，每种实验方法均选用同一批次细胞进行。

1.2.2重组Pgenesil2 PTTG1 siRNA的构建及鉴定

根据Genbank提供的PTTG1 cDNA序列（NM-004129），应用Ambion在线设计软件筛选出三条PITG靶基因序列，分别为PTTG-1：TGGGAGAqL3UAAGTIqEA；PTFG-2：GTCTGTAAAGAC CAAGGGA；PTTG-3：GCATFCTGTCGACCCTGGA，根据上述靶序列设计出三对PTTG1干扰序列。

pGenesil2质粒经BamH I和HindⅢ双酶切，用1%琼脂糖凝胶回收大片段。将上述合成的寡核苷酸片段溶解于退火缓冲液（50μL），分别取正链（2μL）、反链（2μL）和退火缓冲液（16μL），混匀，94℃水浴，3min，自然冷却至室温。用去离子水（99μL）稀释退火产物（1μL），4℃保存。取稀释后退火寡核苷酸链（1μL），Pgenesil2质粒载体（1μL），10×Ligase Buffer（1μL），加入T4连接酶（1μL），加入去离子水（6μL），22℃水浴，过夜。取DH5α（5μL），涂布于LB琼脂平板上（含Kana抗性），置于37℃恒温箱内培养。挑取3个单克隆菌落，接种于LB培养液（5mL，含Kana抗性）中，置于恒温摇床中37℃培养过夜。用质粒提试剂盒提取质粒。经Sal Ⅰ酶切鉴定：将提取的质粒DNA（1μL），10×H Buffer（1μL），Sal Ⅰ（1μL），去离子水（7μL）混匀，37℃水浴反应3h，取5μL反应产物，经1%琼脂糖凝胶电泳验证产物，并将重组质粒菌液送大连宝生物公司测序。

1.2.3PTTG1 siRNA干扰效果鉴定 为提高PTTG1 siRNA干扰质粒的转染效率降低细胞毒性，我们选用脂质体方法进行转染，脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，可以通过膜的融合及内吞作用，将外源物质转移进入细胞内。将胶质瘤U373细胞接种于6孔细胞培养板（1×105/孔）中，次日，当细胞密度达到70%～80%融合时用脂质体2000作为转染试剂进行瞬时转染，每孔中分别加入2μg质粒、8μg脂质体转染试剂和100μL0.01M PBS混匀，室温放置15min后，用PBS洗涤2次，弃上清，每孔中加入900μL含10%胎牛血清DMEM培养基，继续培养48h提取RNA，72h后提取蛋白，用Western Blot检测干扰效果。

1.2.4MTT检测PTTG1 siRNA对胶质瘤细胞增殖能力影响

将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔中细胞数为3×103个，每孔加入100μL培养基，每种细胞重复5个孔，同时设空白对照组（仅加培养基，不加细胞），37℃培养，分别于培养后24、48、72h检测各孔吸光度值（OD值），在检测前每孔加入20μL的MTT继续培养4h后弃培养基，加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，室温避光孵育10min，用酶标仪570nm测定各孔吸光度值（OD值），绘制生长曲线。细胞生长抑制率（%）=（对照组OD值一实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.5细胞划痕实验实验分为两组，实验组：转染PTTG1 siRNA干扰质粒组，收集2mL转染PTTG1 siRNA干扰质粒的细胞悬液接种于6孔板，待细胞生长至单层汇合，用移液器枪头在培养板底部呈“一”划痕，用PBS清洗，更换含1%胎牛血清DMEM培养液分别于划痕后0、18和36h用显微镜观察并照相，记录最初划痕区及不同迁移时间划痕的距离。对照组：转染PTTG1非干扰质粒组起始质粒为PTTG1非干扰质粒，其他步骤同上。

1.2.6Transwell小室迁移实验 本实验分为两组，实验组：转染mGl siRNA干扰质粒组，对照组：转染PTrGl非干扰质粒组。将聚碳酸滤膜（8μm）粘附于Transwell小室上方后，用无血清培养基稀释Matrigel胶（1：3），加至Transwell上室，覆盖整个聚碳酯膜，37℃，放置30min，使Matrigel聚合成胶。用0.25%胰蛋白酶消化各组细胞，PBS洗三次，重悬于含0.1%BSA的培养基中，取2×106/mL细胞悬液100μL加入上室，在下室内加入500μL全培，放于37℃孵箱继续培养24h。弃去上室中的培养液，并用生理盐水棉签缓慢檫去Matrigel胶，使用0.1%结晶紫染色，置于倒置显微镜下观察，10×40倍视野下随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复2次，本部分实验重复2次，并以侵袭细胞占原细胞总数的百分比来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.3统计学分析

通过SPSS21.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用（x±s）表示，若呈正态分布，两组间数据行独立样本t检验，多组间比较行单因素方差分析，若数据不服从正态分布，用秩合检验比较，P

2结果

2.1PTTGl siRNA质粒干扰效果鉴定

构建的三个pGenesil2-PTTG-1干扰质粒经Sal I酶切电泳鉴定及测序证实序列正确，将上述质粒分别转染U373细胞，48h后提取细胞总RNA，用RT-PCR方法检测构建的PTTG1 siRNA干扰质粒抑制PTTG1表达的效果，结果图1-A显示，与转染非干扰质粒的对照组相比，转染3个干扰质粒后PTTGl mRNA表达明显减少，组间多重比较结果显示组间差异有统计学意义（F=12.784，P=0.002），其中PTTG1 siRNA1干扰质粒对PTTG1表达的抑制作用最为明显[（0.47±0.12）vs（1.00±0.15），t=4.679，P=0.001]。再取转染干扰质粒72h后的细胞，用Western Blot方法进一步验证三个PTTG1siRNA干扰质粒对胶质瘤细胞PTTG1的干扰效率（图1-B），结果与RT-PCR结果一致。上述结果均证实三个PTTG1 siRNA干扰质粒可抑制胶质瘤细胞U373中PTTG1的表达，其中PTTG1 siRNA1的抑制作用最为明显。因此，后续的实验选用PTTG1siRNA 1干扰片段来进行。

2.2PTTG1对胶质瘤细胞增殖能力的影响、侵袭和迁移能力的影响

MTT检测细胞增殖活性结果，转染PTTG1siRNA质粒的胶质瘤细胞U373在48和72h细胞增殖能力均显著低于对照组，结果提示PITG1 siRNA质粒可以显著抑制胶质瘤细胞U373的增殖。见表1。

2.3PTTG1对胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响

瞬时转染PTTG1 siRNA干扰质粒于胶质瘤U373细胞48h后，再通过划痕实验检测PTTG1对胶质瘤细胞迁移能力的影响。见图2-A。结果显示，通过定性比较转染PTTG1 siRNA干扰质粒的U373细胞与转染非干扰质粒组，结果发现在划痕后18h和36h的迁移距离明显缩短，其中在36h改变化较为明显，说明PTTG1促进胶质瘤细胞的迁移，抑制PTTG1后可抑制细胞迁移。

采用Transwell小室检测PTTG1对胶质瘤细胞的侵袭能力的影响，图2-B中箭头所指为穿过Martrigel胶的细胞，结果显示与对照组相比，转染PTTG1 siRNA干扰质粒后U373的穿膜细胞百分率明显减少（[58.00±8.72）%vs（36.3±7.76）%，t=-3.214，P=0.032]，这些结果表明PTTG1可以促进胶质瘤细胞的侵袭，抑制PTTG1后胶质瘤细胞的侵袭能力明显降低。

3讨论

胶质瘤是一种预示着不良预后的实体肿瘤。其早期诊断困难，侵袭性强，即使在肿瘤诊断技术与治疗方法日新月异的今天，全世界胶质瘤患者的预后依然没有显著的提高。脑胶质瘤的形成是一个多基因参与的复杂过程，由于原癌基因被激活，抑癌基因失活，从而造成细胞信号传导异常、细胞的凋亡缺陷等，从而造成细胞增殖的失控，最终转化为恶性。近年来，大量研究发现了与脑胶质瘤形成及进展相关的原癌基因及抑癌基因，为胶质瘤的诊断及治疗提供了更为广阔的基础。

垂体瘤转化基因1（pituitary tumor-transforminggene 1，PTTG1）编码的蛋白最早在垂体瘤细胞中发现，之后鉴定为保全素（securin），因其在细胞周期中调控有丝分裂姐妹染色单体的分离，又称分离酶抑制蛋白。PTTG1是一种原癌基因，在很多细胞活动中发挥重要作用，比如有丝分裂、DNA损伤/修复、凋亡和基因转录调节，以及器官发育与代谢过程中起到重要作用。大量证据表明，PTTG1和肿瘤发展、恶性转移密切关系。除了血癌和星形胶质细胞瘤外，甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胸腺癌、肝细胞癌（HCC）、肺癌和食管癌中的mG表达都有所增加。

干细胞培养技术范文第5篇

提起干细胞，首先我们将不得不感谢加拿大多伦多大学的两名科学家Ernest A.McCulloch与James E.Till，他们在上世纪60年代的发现，为我们开启了干细胞研究的大门。

我们现在个子这么高，长这么大只，活蹦乱跳的，最初都由一个细胞发育而来，它就是受精卵——最高级的干细胞。随着我们逐渐长大，干细胞并没有消失，而是分化出各种多能干细胞，藏身在我们身体内的各个角落。比如我们血液中的红细胞每120天就要更新一次，每小时要制造约5亿个新的红细胞，如此庞大的工作量，只有骨髓中的造血干细胞才能胜任。或者我们摔了一跤，受伤了，但是没几天又完好如初，这正是皮肤基底层干细胞的神奇功能。当我们的伤口很深，伤及真皮的时候，你会发现皮肤很难愈合，甚至需要植皮手术，因为这里的干细胞已经不幸阵亡。

那么我们就会有—个疑问了，为什么受精卵能发育成—个人，而造血干细胞只能发育成血细胞呢?它们的遗传物质不是—样的么?

这就是我们细胞内基因的神奇之处了!不同的组织细胞，虽然有着相同的遗传物质，但是它们面临着各种调控方式，DNA甲基化，干扰RNA，组蛋白修饰等，于是有的基因在肌肉组织里表达，但是在神经里被抑制了，有的基因在血细胞里高表达了，但是在淋巴里又低表达，有的基因表达的蛋白在脑组织里被修饰成了圆形，在胃里又被剪切成了方形。所以当受精卵发育成造血干细胞等其他成体干细胞的时候，某些基因就被成功地调控。

科学家们一直试图去操纵干细胞，这也是干细胞技术发展的@重要方向，目前也逐步取得了一定成果。一旦实现完全操控干细胞，让干细胞七十二变，它绝对不敢少—下。

干细胞技术成长路

1998年，威斯康星大学的James A.Thomson等人将人卵体外受精后，胚胎培育到囊胚期，然后提取内细胞团，成功培育出了全能干细胞株。与此同时，约翰霍普金斯大学的John D.Gearhart从人工流产的胚胎中提取生殖母细胞，也成功培养出了全能干细胞株。这些由胚胎获取的干细胞虽然很难像受精卵那样发育出一个完整的个体，但发育成多种组织却不在话下。如果能用这些细胞替补人体中那些老弱病残的细胞，人类也许能够克服很多种疾病。

日本一个研究小组利用人胚胎干细胞制造出能够产生神经传导物质多巴胺的神经细胞，然后将这些细胞移植到4只患有帕金森症的食蟹猴脑部，并持续观察—年，结果发现猴子手脚震颤的症状有明显改善。虽然我们不知道这些猴子有没有同时变聪明，是否能在未来成功崛起，但是我们知道，干细胞的注入很有可能有效减轻这些灵长类动物的帕金森症。

胚胎干细胞有着非常大的应用前景，却也面临着非常强大的社会舆论压力，尤其是伦理方面的问题。Thomson在培养胚胎干细胞之前，就曾咨询本校的伦理学教授，教授忧心忡忡地问他：

。将来如果把这些细胞注入老鼠体内，它们增殖并占据这些小动物的大脑，那时候它们究竟是人还是老鼠?”

Thomson自己就曾说：“提及胚胎干细胞，如果你丝毫没有不舒服的感觉，那么你一定没有足够仔细地思考过这个问题。”因此，美国立法机构对此戒心重重，直到201 0年才首次批准加州的Geron公司，使用人胚胎干细胞用于治疗急性脊髓损伤患者。

相比于胚胎干细胞，成体干细胞的实现就不会面临如此沉重的压力，当然，它又不可避免地面对着克隆人、致癌性的指责。2007年山中伸弥教授利用逆转录病毒将四种基因分别导入实验室培养的老鼠和成年人的皮肤细胞内，使它们失去分化特性而成为。诱导多能干细胞(iPS)。随后麻省波士顿儿童医院的乔治-戴利等人则更进一步，用类似的方法，直接从志愿者身上提取皮肤细胞，完成了皮肤干细胞的转变。相比于胚胎干细胞，诱导多能干细胞(iPS)由于存在着病毒侵染诱导的过程，科学家们一直担心它们发生癌变。但日本冈山大学妹尾昌治领导的研究小组，成功利用小鼠细胞培养出iPS细胞，然后向培养液中添加曾培养过肺癌、皮肤癌等癌细胞的液体，成功引起了iPS细胞的癌变。妹尾昌治指出，少数iPS细胞癌变也许是受到癌细胞碎片或者其排出的分泌物影响。相信在不久的未来，科学家们能够完全掌握诱导干细胞技术，那时，器官移植将不会如此困难，也不会面对排斥反应等诸多问题。

干细胞显身手圈

血荒

血荒，已成为最近几年看病难中，最为突出的问题之一。手术停做，病人不得不自备血液的现象时有发生。在献血比例较低的大背景下，如何才能解决血荒的问题?法国科学家告诉了我们答案。来自法国巴黎皮埃尔与玛丽居里大学的卢茨杜艾团队，首次将干细胞技术运用到“人造血”上，并将培育的血液输入人体，取得了成功。

杜艾团队首先从志愿者骨髓中抽取造血干细胞，然后利用生长因子激发这些干细胞，产生大量红细胞。在给这些人造细胞做上标记以供追踪后，他们把其中的100亿个细胞共2毫升人造血注射回捐献者体内。5天后，这些人造血细胞中至少还有94％仍在捐献者体内循环，26天后，41％到63％的血细胞仍然存活，与天然的血细胞存活率基本—致，这也就证明了这些人造血细胞同天然细胞一样，能在人体内正常存活，行使功能将氧气输送至全身。

这无疑是一大喜讯，也许过不了多久，血荒时代就要终结。

人造器官

—名居住在冰岛的非洲学生，于2011年6月9日成为全球第一例体验人造器官移植手术的幸运儿。此前，他患有严重的气管癌，处于癌症晚期，气管已完全堵塞，一直苦于没有合适的捐献者。但是在意大利干细胞专家保罗·马基亚利尼领导的国际科研团队帮助下，由瑞典外科医生操刀，最终成功康复出院。

科学家们利用—种类似塑料的聚合材料，设计制作了一个Y形的支架和一个用于培育病人干细胞的生物反应器，然后抽取患者自身的干细胞培养，等到新细胞成长起来后，科学家们将其“种植”在支架上。仅仅两天之后，可用于移植的气管细胞就生长出来。由于这些细胞来自于患者自身的干细胞，当气管被植入后，没有遭遇到任何免疫系统的排斥。

不同于以往的人造器官，此次植入的人造气管，和人体天生的非常类似，不仅能够正常收缩、舒张，产生人体特定的分泌物，还能够和被缝合的组织很好地生长到—起，融为一体。大家可能会有疑问，怎么才能确保这些干细胞不会无限分裂生长下去呢?这是由于，正常的细胞之间存在着天然的接触抑制机制，两种细胞一旦接触，发生了细胞表面的信号传递，生长就会停止，这点与癌细胞是完全不一样的。

当然还有些同学会有疑问：以后要是能换脑了，我还是我么?恐怕这个问题只有以后才能知道。

冷静对待干细胞

干细胞技术虽然有着非常诱人的应用前景，也已经治愈了相当多的患者，但是干细胞不是仙药，不能包治百病。在干细胞技术上仍然有很多难点需要——攻克，长期效果也存在着一定的，所以患者们在面对干细胞技术时，—定要审视再三，冷静之后再做决定。

2001年，一个惠有共济失调毛细血管扩张症的9岁小男孩，在莫斯科的一家医院接受了小脑内和鞘内人胚胎神经干细胞注射治疗。试图治愈这个罕见的遗传性痰病。4年后。由于经常性的头疼，小男孩再次接受检查，却发现患上了多病灶的脑肿瘤。科学家们通过各种方式检查，提出神经干细胞可能与肿瘤的发生有关，这个小男孩也因此成为首例供体源性的脑肿瘤患者。

美国的《自然》杂志调查发现，中国的大小诊所通过网站或宣传手册，公开宣称通过干细胞疗法可以治疗不少疑难杂症，不仅吸引了成千上万的国内患者前去就医，同时还迷晕了数以千计的海外患者，给人一种干细胞疗法成为主流疗法的假象。但是，实际上干细胞疗法至今仍然处于试验阶段，并没有广泛应用于临床。小男孩的例子也告诉我们，部分疗法甚至对患者健康是有危害的。