1光密度定量的意义

医学形态学研究随着科技的飞速发展,常用研究方法从细胞水平(光镜组织切片、细胞培养、电镜透射扫描、免疫电镜、流式细胞技术)发展到蛋白水平(免疫组化、WesternBlotting)和基因水平(原位分子杂交、PCR及测序等)。免疫组化染色方法自1986年由两名中国人发现S-P法以后,以其便于交流,有配套的即用型抗体试剂盒和显色试剂盒直接滴加,染色时间短,灵敏性高,特异性强等明显优点,被实验医学研究者广泛采用。对于用免疫组化或原位杂交法染色的组织切片、细胞涂片,测定其特异性染色阳性区的光密度值、积分光密度值,相对定量的表示某种特定蛋白的含量,受体配体、抗原抗体的结合程度或酶显色的情况。传统判定染色结果的方法是在显微镜下观察阳性细胞数,小于25%为弱阳性(+),25-50%为阳性(++),50-75%为强阳性(+++),大于75%为特强阳性(++++)。现今应用图像分析系统测量染色阳性区的光密度参数(光密度、积分光密度),用数值定量的表示染色程度,有利于进行统计学数据分析,使结论更客观更准确。

2•1光密度(OpticalDensity)

根据Beer-Lamb吸收定理:一束单色平行光透过某种分布均匀的物质,光能被吸收,光能吸收量等于物质的克分子量;物质对光吸收的多少与照射光强度无关。光密度OD=Lg(1/T),平均透射率T=Greyi/Greyo×100%,Greyi为被测对像的平均灰度值(出射光强度,即透射光强度),Greyo为空白区域的平均灰度值(入射光强度,即本底光或光源的强度)。设定图像分析系统光密度值和灰度值之间的转换关系称光密度定标。例如八比特(Bit)图像为256级灰度:空白本底的OD空=LgGreyo/Greyi=Lg200/200=Lg1=0,全黑图像的OD黑=LgGreyo/Greyi=Lg255/0→∞,理论上光密度值是(0<OD<∞)大于零小于无穷大的。实际上,假设出射光强度比入射光强度低100倍OD=Lg255/2.55=Lg100=2,出射光强度比入射光强度低10倍OD=Lg255/25.5=lg10=1,所以多数情况下光密度值为0<OD<1的数。定标时设空白本底的光密度值OD=0,全黑图像的光密度值OD=2,计算机自动得出OD-Grey曲线,并按此关系进行灰度值和光密度值的转换,计算出光密度值。从另一个角度看,平均透射率反映物体的透光性,亮意味着透光多,暗意味着透光少,光被吸收的多。T=10-kcd式中k为克分子吸收系数,c为物质的浓度,d为物质的厚度(光程),光密度值OD=lg1/T=10kcd=kcd,可见光密度OD与物质的浓度C成正比,光密度值的大小代表染色的深浅,反映物质的相对浓度。

2.2积分光密度(IntegratedOpticalDensity)

积分光密IOD=(GV.LgMaxGVGV)为构成被测对像的所有像素点的光密度的和。从另一个角度看,物质的浓度C=M/V(质量/体积)=M/Area×d光密度OD=kcd=K×M/(Area×d)×d=KM/AreaBeer-Lamb吸收定律要求物质分布是均匀的,但实际生物样品中的被测对像分布大都是不均匀的,图像分析软件测量时将若干个像素定义成一个像元,像元很小,设面积为a,每个像元内物质分布被认为是均匀的。所以可认为物体整合光密度IOD=a×(OD1+OD2+OD3…ODn)=a×n×OD=Area×OD=Area×KM/Area=KM。由此可知,积分光密度与物质的质量M成正比,积分光密度值的大小代表被染色物质的多少,反映物质的相对含量。光密度定量为相对定量,需要对照组,测量时的系统误差对实验组和对照组而言是同样的,不会对结果有影响。需要注意的是应选择无疵点、无污渍的薄厚均匀的载玻片和盖玻片,使用相同的封片剂。严格控制切片的厚度和染色条件的一致,测量光密度的样品最好不要复染,尽量减少样品染色的不一致或不均匀。定购染色试剂时最好同时购买阳性对照片,以便做图像分析时用它准确设定阳性阈值(Thresh-oldRang)。图像获取时光的条件要求严格一致,尽量用40倍的物镜采集图像,以便测量时精确分割图像。