本文作者：杨志华1,2赵曼3哈小琴1,2作者单位：1.兰州军区兰州总医院检验科2.甘肃省干细胞与基因药物重点实验室3.兰州大学第二临床医学院

肝细胞生长因子（HGF）又称离散因子（SF），最初作为肝细胞有丝分裂原从肝部分切除大鼠的血液中分离，其活性不具种属特异性并可刺激肝细胞合成DNA［1］。HGF具有广泛的生物学效应，参与多种细胞的增殖、迁移和形态发生。同时研究发现，HGF是一种神经营养因子，对神经具有营养和保护作用，目前对HGF在基础及临床方面的研究皆已取得较大进展。

1HGF及其受体结构

HGF是可溶性细胞因子，属于纤溶酶原依赖性的生长因子家族。HGF由间叶起源的细胞合成和分泌，组织细胞分泌的无活性单链前体蛋白在适宜条件下经胰蛋白酶样蛋白水解酶作用，裂解为有活性的杂二聚体，由α链（69kD）和β链（34kD）通过一对二硫键相连而成。α链N末端有一发夹结构，其C末端有4个Kringle结构域，分别为K1、K2、K3及K4区。其中，发夹结构和K1区是HGF与受体c－Met结合的关键部位，而发夹结构和K2区一起构成HGF与肝素及硫酸乙酰肝素亲和的必需结构；β链组成1个无功能的丝氨酸蛋白结构区，与HGF的促细胞运动作用有关。HGF受体是原癌基因c－Met编码的一种跨膜蛋白，由50kD的α链和145kD的β链经二硫键相连成杂二聚体，具有Ⅱ型酪氨酸激酶受体的结构，含细胞外结合区、跨膜蛋白区、胞内蛋白激酶区。α链和β链N末端位于细胞表面，N末端胞外区有参与HGF结合的半胱氨酸富集区，C末端包括跨膜区、细胞质内区、酪氨酸激酶和自身磷酸化位点。HGF与细胞膜上受体结合后，受体构象发生变化，激活受体本身的酪氨酸蛋白激酶，引起系列级联反应，使其发挥正常的生物学活性。

2HGF及其生物学活性

HGF可刺激细胞增殖，修复组织器官的损伤，发挥有丝分裂原的作用；促进胚胎的发育及各类组织器官的形态发生，发挥形态发生原的作用；促进细胞的迁移和侵袭，对某些组织的形成和发育及肿瘤的转移、侵袭具有重要意义。最近研究发现，HGF对中枢系统神经元的生长、分化、修复和再生也起重要作用。

3HGF及其受体在中枢神经系统中的表达

在神经系统中HGF及其受体表达广泛，在神经细胞和神经胶质细胞中都有合成和表达，在神经细胞中的表达比胶质细胞更强。在成年鼠大脑皮质，HGF在皮质Ⅳ、Ⅴ层的锥体细胞上表达，而c－Met则在皮质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ层的神经元以及海马、小脑颗粒细胞层、室管膜细胞、脉络膜细胞、松果体、初级嗅皮质、扣带回皮质和内嗅皮质、隔板、脑桥等部位表达。另外，HGF和c－Met在脊髓背根神经节、三叉神经中脑核等均有表达［2］。

4HGF在中枢神经发育中的营养作用

作为中枢神经系统的营养因子，HGF在发育中能够促进中枢神经系统神经不同亚群神经轴突的存活和生长，促进胚胎干系细胞的分化，参与皮质神经元细胞的起源、分化、迁移及神经元生存过程中的发育和维持，促进海马神经元成熟，促进少突神经胶质细胞轴突的生长和发育。Sun等［3］通过定量PCR检测和免疫组化分析HGF及其受体c－Met在小鼠大脑皮质发育过程中的表达和功能，结果显示HGF参与皮质神经元在分化、运动发生以及神经起源、神经元生存过程中的发育和维持。有报道HGF和c－Met通过Akt／GSK－3β途径的活化可调节海马神经元分化过程中树突早期阶段的成熟［4］。还有研究表明HGF通过调节突触N－甲基－D－天冬氨酸（NMDA）受体支架蛋白的表达，促进幼海马神经元兴奋性突触的成熟［5］。Nicoleau等［6］报道，内源性HGF在脑室下带（SVZ）区神经干细胞的生长和自我更新中发挥着重要的作用。其通过免疫组化、ELISA等方法检测表明培养的SVZ细胞产生并释放HGF，HGF中和抗体能够抑制SVZ细胞条件培养基中SVZ细胞的增殖。这表明内源性的HGF对SVZ细胞具有促有丝分裂作用。同时，脑部免疫组化证实HGF由表达巢蛋白的细胞产生，而c－Met则由SVZ区未成熟的细胞表达。脑内注射HGF可促进SVZ细胞的增殖，而脑内注射HGF中和抗体后SVZ细胞增殖减少。Ohya等［7］认为HGF对多种神经元具有神经营养作用，在大鼠出生后的第3天（P3）、第7天（P7）和第14天（P14）对大鼠纹状体的c－Met／HGF受体或磷酸化的c－Met和NG2或RIPP7进行双重免疫染色、westernblot分析、电子显微镜检查，研究结果表明HGF增加少突神经胶质细胞祖细胞的增殖并减少其分化生成髓鞘少突神经胶质细胞，由此推测，HGF能促进少突神经胶质细胞轴突的生长。实时定量RT－PCR显示，从P7到P14，纹状体HGFmRNA表达下调，这可能有利于少突神经胶质细胞的祖细胞分化为生成髓鞘少突神经胶质细胞。由此表明c－Met信号和HGF的调节在少突神经胶质细胞的发育中发挥着重要的的作用，HGF促进大鼠出生后发育中少突神经胶质细胞的增殖，抑制它的分化。Lan等［8］证实外源HGF可诱导纹状体多巴胺能神经前体细胞增殖和迁移，相应的抑制剂能抑制或阻断外源HGF的这种作用，这为帕金森病的治疗提供了新的途径。

5HGF对脑损伤的保护作用

5．1HGF对体外培养的神经元的保护作用

HGF作为一种神经营养因子，能促进体外培养的皮质神经元、海马神经元、星形胶质细胞等多种神经细胞的增殖，抑制其凋亡，增强其耐受能力，从而对神经元起到保护效应。黄韵等［9］通过研究腺病毒介导人肝细胞生长因子（Ad－HGF）对体外无血清培养所致大鼠皮质神经元损伤的保护作用，证实Ad－HGF对接种后2h转染组无血清培养所致的神经元损伤有显著的保护作用，对接种后第5天转染的皮质神经元无血清所致的损伤虽亦具有一定的保护作用。Akita等［10］通过兴奋性毒素NMDA诱导海马神经元兴奋性神经毒性作用，HGF处理能降低NMDA受体亚基NR2B的突触定位，抑制兴奋性中毒之后突触前蛋白突触蛋白Ⅰ下降。且HGF处理后，随着兴奋性毒素NMDA的增加NR2B亚基的水平下降趋势减弱，在环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化作用中，去极化反应的NMDA受体的活化受到抑制。由此表明HGF能够降低NMDA受体亚基突触的局部定位，阻止细胞内信号通过NMDA受体，防止神经元细胞的坏死，从而保护体外培养的海马神经元细胞的存活。贺芳等［11］在研究HGF对缺氧、缺糖诱导的星形胶质细胞损伤及凋亡的影响时发现HGF能减少星形胶质细胞凋亡，并呈一定的剂量依赖关系，从而对缺氧缺糖引起的星形胶质细胞损伤具有保护作用。此外，He等［12］观察HGF是否对培养的受到缺氧／再充氧大脑皮质神经元具有直接的保护作用，并对其作用的细胞内信号调节机制进行研究，结果发现HGF预处理能够减少缺氧／再充氧所导致的大脑皮质神经元细胞生存减少和凋亡细胞数目的增多。HGF在皮质神经元中能够刺激ERK1／2和Akt的活性。而ERK活性的抑制能够完全消除HGF的保护作用，Akt活性的抑制能够降低但是不能完全消除HGF介导的神经保护作用。由此提示，HGF的神经保护作用依赖于ERK1／2通路，而很少依赖于PI－3K／Akt通路。而且，HGF预处理能够显著降低缺氧／再充氧诱导的Bcl－2和Bcl－xL的表达，Bcl－2和Bcl－xL可能促进HGF的保护作用，但对Bax的表达没有影响。Doeppner等［13］在研究HGF对下丘脑诱导的持续神经营养作用潜在机制的体外研究发现，HGF能够促进下丘脑神经球形成和降低缺氧损伤中caspase－3的表达。Tnges等［14］应用重组的HGF作用于培养的视网膜神经节细胞细胞，发现其存活率明显增加，其机制可能与c－Met的磷酸化以及之后的Akt和MAPK下游信号通路中有关神经存活因子的激活有关。此外，Nicoleau等［6］发现HGF促进SVZ细胞增殖并促进其形成神经球。总之，HGF不仅在中枢神经系统的发育中不可或缺，在中枢神经的损伤修复中也发挥着重要作用，尤其在脑缺血损伤中。

5．2HGF对脑缺血损伤的保护作用

脑缺血引起的不可逆损伤和神经变性性疾病，可能会导致进行性痴呆和大脑认知功能的衰退。因为脑缺血损伤的整个过程极为复杂，用内源性多功能因子治疗防止脑缺血损伤的并发症是个很好的选择。作为多效应因子，在脑缺血损伤中，HGF能够改善脑缺血、抑制凋亡通路的激活，保护神经细胞免受缺血损伤，同时能够减轻局部缺血对血脑屏障的破坏。Trapp等［15］报道HGF表达于缺血再灌注的大脑和凋亡的神经细胞，而在坏死的神经细胞未见表达。杨燕等［16］在研究大鼠局灶性脑缺血后HGF表达的动态变化时发现脑缺血后可上调HGF在大脑的表达，提示HGF参与了缺血性脑损伤的病理发展及修复过程。Wakatsuki等［17］研究发现脑缺血诱导神经元HGF的表达，并在脑缺血再灌注后发挥神经保护作用，延迟海马神经元的坏死，抑制导致抑郁和焦虑相关行为的增加，在海马神经元的成熟和功能中发挥着重要的作用。Takeo等［18］通过向大鼠体内注射微球体使之形成栓塞，诱发脑部水肿，之后通过右脑室注射HGF进行治疗，结果发现在微球体栓塞的大脑右半球组织水明显增加，微球体栓塞诱导的组织中的钠离子和钙离子增加，而组织中的钾离子和镁离子降低。HGF的治疗能抑制组织水中钠离子和钙离子的增加，但不能减少钾离子和镁离子的增加，提示HGF能抑制微球体栓塞引起的大鼠缺血性脑水肿的形成。Hu等［19］发现HGF具有对抗H2O2诱导的大鼠皮质神经元凋亡作用，其作用机制可能与HGF抑制凋亡的线粒体途径，降低神经元caspase－3活性有关。Niimura等［20，21］发现在前脑局部缺血时，HGF主要通过抑制DNA的氧化损伤和阻止PARP／p53／AIF途径的活化来抑制海马神经细胞的坏死，从而发挥其保护中枢神经的作用。而HGF对海马CA1区大脑局部缺血引发的细胞坏死的保护效应与神经元的APE／Ref－1表达量的提高和胶质样细胞中还原型辅酶Ⅱ氧化活性的抑制有关。还有研究者用HGF治疗小鼠急性脑缺血45min脑纹状体损伤，通过对缺血的小鼠纹状体持续4周的观察，研究脑损伤和神经系统的恢复。发现接受HGF处理的小鼠在脑缺血24h后能够保持血脑屏障的完整性，这与脑缺血4h和24h分别受到基质金属蛋白酶（MMP）－2和MMP－9的抑制作用有关。而HGF诱导的持续神经营养作用的潜在机制可能是通过增加神经前体细胞神经元的分化来促进细胞的增殖和改善神经血管的重塑，从而长期保护神经［13］。Shang等［22］通过短暂的大脑中动脉栓塞之后立即再灌注建立大鼠脑缺血再灌注模型，并局部涂抹给予HGF进行治疗，在大脑中动脉栓塞的第1、2天和第3天注射5－溴脱氧尿苷，2次／d，结果发现，第14天HGF显著的降低脑梗死体积和TUNEL阳性细胞的数量，增加室下区5－溴脱氧尿苷阳性细胞的数量和缺血区5’－溴基－2’－脱氧尿苷阳性细胞分化成成熟的神经元。且在HGF处理组大鼠的缺血边界观察到血管发生和突触发生增强，显著降低神经胶质瘢痕的形成和大脑软脑脊膜疤痕的厚度。由此证实HGF具有显著的神经营养作用，促进神经发生、血管发生和突触发生、抑制大脑中动脉栓塞之后的纤维变性。此外，Shang等［23］还研究了HGF在大鼠大脑中动脉闭塞后对梗死体积的影响、抗凋亡效应、抗自噬效应及其变化。研究者通过HE染色分析脑缺血梗死体积，TUNEL染色检测抗凋亡作用，westenblot检测LC3和磷酸化的mTOR／Ser（2448）（p－mTOR）评价脑组织的抗自嗜作用。结果显示，HGF能够显著降低脑缺血后的梗死体积；大脑中动脉栓塞后LC3－I和LC3－II的数量明显的增加，而HGF能够显著的降低LC3－I和LC3－II的表达量。HGF显著的增加p－mTOR阳性细胞的数量，并显著的降低TUNEL、LC3和LC3／TUNEL双阳性细胞的数目。在LC3和TUNEL阳性细胞中大约有34．3％LC3／TUNEL双阳性细胞。提示HGF的保护效应不仅与抗凋亡有关而且与抗自噬作用有关，可能2种细胞死亡的方式在同一个细胞和同一时间发生，HGF能够改善细胞的这2种细胞死亡的方式。Takeuchi等［24］通过超声介导的基因转移方法将过表达的人HGF的DNA质粒转移入具有认知功能障碍的小鼠模型中，结果表明，在小鼠的行为试验中，其认知功能障碍得到明显的改善。HGF可能通过以下途径改善小鼠的认识功能障碍：①显著恢复海马齿状回血管密度；②上调脑源性神经营养因子（BDNF）；③显著降低氧化应激；④促进突触的生长。Takeo等［18］通过微球体栓塞模型，检测HGF在脑缺血诱导的学习和记忆功能障碍，神经细胞坏死和内皮细胞损伤中的作用。研究表明HGF治疗能够通过抑制凋亡诱导因子进入神经核来保护海马神经元，对抗缺血诱导的细胞死亡，同时，HGF具有抑制脑栓塞后的组织降解，改善学习和记忆功能，其机制可能是通过防止大脑血管的损伤来发挥保护作用。综上所述，HGF作为一种多效应因子，通过多种途径发挥对大脑的保护，将来其可能成为治疗并发的脑缺血损伤疾病的一种新的策略。

6HGF对脊髓损伤的保护作用

此外，HGF能够促进损伤脊髓神经再生和突出重塑，促进损伤神经修复及血管生成，从而保护脊神经。余清平等［25］观察HGF在大鼠脊髓和背根神经节的表达，发现脊髓和背根神经节内的HGF通过与受体c－Met结合可能在神经再生及突触重塑性方面起一定作用。Zheng等［26］通过大鼠坐骨神经结扎模型，检测HGF和c－Met在背根神经节和腰脊髓的时空表达。在坐骨神经结扎后1～14d，身体同侧的L4－L5背根神经节HGF的表达显著下降，而在第5天和第7天表达达到最低水平。相对的，HGF在腰部脊髓的表达没有明显的变化。在坐骨神经结扎后，c－Met在脊髓腹角的表达保持稳定。由此表明HGF／c－Met系统是被外周神经损伤诱导的一种独特的信号通路进行时空调节的，这种信号通路能够促进损伤神经的存活，尤其是成熟的背根神经节神经。然而，Pan等［27］报道外周神经的损失并不能诱导脊髓HGF表达量的增加，其在外周神经损伤后用，用克莫司诱导脊髓内源性HGF的高表达，从而保护神经并促进轴突的延伸。Kitamura等［28］在脊髓神经损伤后，给予携带有HGF的无毒性单纯疱疹病毒，检测是否能促进脊髓损伤的修复。发现在急性脊髓损伤中，HGF基因对传输受损的脊髓发挥多重有益效应，能够显著的促进脊髓损伤后神经元和少突胶质细胞的存活及血管发生，促进脊髓损伤的内源性修复，从而减少损伤的区域并促进轴突再生和功能恢复。

7HGF在中枢和外周神经系统疾病中应用的前景

目前国内外已经开展了HGF对肌萎缩侧索硬化［29］、Alzheimer病［30］和缺血性脑血管病的临床前研究。但内源性HGF的作用短暂而微弱，而且有效药效浓度低，不足以完全修复各种较为严重的损伤。因此，有必要应用外源性HGF来促进损伤神经组织的修复。随着研究的深入，研究者逐渐采用工程技术手段将HGF基因导入特定的载体内，使其安全高效地在机体内表达。目前用作HGF载体的主要有腺病毒、减毒沙门氏菌、日本血凝集病毒及大肠杆菌，且研究证实这些载体具有较好的安全性。但在临床应用方面还存在一些问题：①HGF有促进肿瘤浸润的作用，其用于不同神经损伤的最佳治疗剂量和有效血药浓度尚未确定，大剂量应用HGF是否会产生意想不到的不良反应？有无引起新肿瘤的潜在可能？②由于血脑屏障的存在，使得HGF很难通过全身循环到达中枢神经系统，目前HGF给药方式主要是局部用药，对中枢神经损伤的治疗主要是通过蛛网膜下腔注射，风险较大，如何使HGF简单、安全、高效通过血脑屏障，是临床急需解决的难题之一；③HGF作为一种多效应因子在神经损伤治疗中的深层机制尚不完全明确。HGF在应用中尤其是大剂量应用可能有许多副作用，故对其功能和机制需作进一步研究，并应利用基因工程对HGF进行改造，使其活性更稳定、作用更特异、药效更持久、毒副作用更小。如何应用简单、特异而有效的方法使HGF在神经性疾病的治疗中达到临床所期望的疗效已经成为目前基础及临床研究工作的主要方向。