【摘要】目的检测结直肠癌组织中E-钙粘素的表达及其淋巴结微转移,探讨两者间的关系。方法以CK20mRNA为标记物,应用RT-PCR对60例结直肠癌根治性手术切除的淋巴结标本共782例进行检测;免疫组化法(SP法)检测结直肠癌组织、癌旁组织、淋巴结微转移及正常对照组中E-钙粘素的表达。通过二者的综合分析,试图发现抑癌基因E-钙粘素在结直肠癌淋巴结微转移的生物学行为中的作用。结果CK20法检出45例(75.0%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为436个(55.8%);常规病理学检出34例(56.7%)患者有淋巴结转移,检出阳性淋巴结数为356个(45.5%);两组比较,差异具有统计学意义(χ2=16.72,P<0.05)。11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(54.5%)E-Cadherin表达阴性,而15例未检出淋巴结微转移癌组织中仅有1例(6.67%)表达阴性,两者比较差异有统计学意义(χ2=4.160,P=0.041)。结论E-Cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。

【关键词】结直肠癌;E-钙粘素;淋巴结转移;逆转录聚合酶链反应

【Abstract】ObjectivePurposeTodetecttheexpressionofE-cadherinincolorectalcarcinomaandlymphnodemicrometastases,andinvestigatetheirrelationship.Methods82casesoflymphnodesimplewasdectectedwithRT-PCRmethodusingCK20mRNAacridiniumester.inscreeningcolorectalcarcinomalymphnodemicrometastases.E-Cadherinexpressionanalysedbyimmuno-histochemicalstaining(theSPmethod)incolorectalcancertissue,tissuenearbycancer,thenormalcontroltissue.ResultsIn60casesofcolorectalcarcinoma,theexpressionofE-Cadherinwas71.67%.Numberofpositivenodeswas55.8%,theexpressionofE-cadherinwas56.7%(34cases)andnumberofpositivenodeswas45.5%(356cases)throughroutinepathologicalexamination.ThelowlevelexpressionofE-CadherinwaspositivelycorrelatedwiththeDukesstaging,serosainfiltration,lymphnodeandlivermetastasisofcolorectalcarcinoma(χ2=16.72,P<0.05).TheexpressionofE-Cadherinwasnegativein6ofthe11patientswithlymphnodemicrometastases,andin6.67%1ofthe15patientswithoutlymphnodemicrometastases(χ2=4.160,P=0.041).ConclusionThenegativeexpressionofE-Cadherinmaycontributetolymphnodemicrometastasesincolorectalcarcinoma.

【Keywords】

colorectalcarcinoma;E-Cadherin;Lymphaticmetastasis;Rt-pcr

结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。每年有10%的恶性肿瘤患者死于结直肠癌[1,2]。术后复发和转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。在实施了根治性手术的结直肠癌患者中,仍有20%~50%的患者死于术后肿瘤的局部复发和转移[3,4],有研究认为该现象与结直肠癌淋巴结微转移有关。E-Cadherin粘附分子介导细胞粘附的紊乱涉及肿瘤的发展和转移。E-Cadherin表达或功能的丧失与癌细胞丧失分化和较高的侵袭能力有关。本研究通过免疫组化方法检测E-Cadherin粘附分子在结直肠癌和转移灶的表达,以CK20为靶目标,应用RT-PCR法检测结直肠癌淋巴结的微小转移,以探讨结直肠癌浸润转移相关基因的表达与临床分期、浸润转移的关系。探讨结直肠癌组织中E-Cadherin的表达及其与淋巴结微转移的关系,试图对结直肠癌转移做出预测和早期诊断,为临床治疗提供依据和手段。

1实验材料及方法

1.1实验材料

1.1.1病例与标本收集我院2005~2007年散发性结直肠癌根治术后标本60例,其中男32例,女28例;年龄28~79,平均58.4岁。所有患者术前均未行放、化疗;剔除遗传性非息肉病性散发性结直肠癌和家族性腺瘤性息肉病。分化程度:高分化23例,中分化21例,低分化16例;淋巴结转移34例,无淋巴结转移26例;TNM分期I期6例,II期26例,III期22例,IV期6例。术中采集散发性结直肠癌患者肿瘤周围肿大淋巴结共782个,剖开,一半行常规术后病理,另一半保存于-80℃冰箱备用。选择远癌“正常”大肠黏膜组织(距癌灶>4cm)和癌旁(距癌灶<2cm)大肠黏膜组织各10例作为对照观察。所有标本经10%福尔马林液固定,常规石蜡包埋。本研究得到医院伦理委员会批准,所有患者本人均签署知情同意书。

1.1.2试剂鼠抗人E-Cadherin单克隆抗体和S-P试剂盒(Zymed公司)。TRIzolReagent(Invitrogen公司),TAKARAAMV逆转录试剂盒(Takara公司),TAKARALATaq(Takara公司),PCR试剂(Takara公司),DNA分子量Marker(晶美公司)。

1.2方法

1.2.1总RNA的抽提采用标准TRIzol法(参照说明书)提取术后淋巴结标本的总RNA,凝胶电泳和分光光度计检测RNA浓度和纯度。

1.2.2cDNA制备总RNA样品1μl,依次加入OligodT(18)0.5μl,MgCl22μl,10×RTBuffer1μl,RNaseFreedH2O3.75μl,10mmol/LdNTP1μl,RNaseInhibitor0.25μl,AMVReverseTranscriptase0.5μl。总反应混合物于30℃反应10min,42℃反应30min,99℃反应5min,5℃反应5min。

1.2.3引物的合成在NCBI数据库中查找编码人类基因CK20的核酸序列,其登录号为NM_019010,该序列长1817bp,编码序列CDS(CodingSequence)位于43-1317bp间。以此序列为基础,在CDS区内设计引物。上游引物5’-ACCTAAATGACCGTCTAGCGAGC-3’下游引物5’-CACATTGACAGTGTTGCCCAGAT-3’扩增片段为449bp大小,引物由上海英俊公司合成。

1.2.4PCR反应和分析采用RT-PCR方法,以人结直肠癌淋巴结cDNA为模版.反应体系为50μl:cDNA模版1μl,10×LAPCR缓冲液5μl,25mmol/LMgCl25μl,20pmol/μl上游和下游引物各1μl,10mmol/LdNTPMixture2μl,LATag酶0.5μl,补去离子水至50μl。PCR反应条件:94℃预变性3min;94℃变性30s,58.5℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃再延伸5min。反应完毕后进行电泳分析。

1.2.5结直肠癌组织切片厚4μm,0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复,S-P免疫组化染色。染色步骤按说明书进行,DAB显色,苏木精复染胞核。PBS代替第1抗体作阴性对照。

1.3统计学方法资料的统计分析在SPSS13.0软件包中进行,数值变量以均数(95%可信区间)表示,计数资料用率来表示,两组间率的比较采用χ2检验法。并采用诊断性实验分析方法计算CK20与传统病理切片技术诊断结直肠癌淋巴结转移的准确度、敏感度和特异度。

实验结果:

图AE-Cadherin在正常大肠黏膜上皮细胞中的表达40×

图BE-Cadherin在结直肠癌组织中的表达40×

2结果

2.160例散发性结直肠癌患者的782个受检淋巴结经常规病理学检查,34例(56.7%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为356个(45.5%)。而采用RT-PCR法检测CK20mRNA的表达情况来判断淋巴结转移,结果显示,45例(75.0%)患者有淋巴结转移,较病理学检查结果新增11例,差异具有统计学意义(χ2=4.483,P=0.034)。阳性淋巴结总数为436个(55.8%),较病理学检查结果新增80个,差异具有统计学意义(χ2=16.371,P<0.001)。

2.2E-Cadherin表达与结直肠癌临床病理参数的关系E-Cadherin在癌组织中的表达阳性率显著低于癌旁组织(P<0.05)。E-Cadherin低表达与结直肠癌Dukes分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移呈正相关(P<0.05)。

2.311例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例E-Cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例表达阴性,两者差异有统计学意义(χ2=4.160,P=0.041)。3讨论

E-Cadherin又称细胞-细胞粘附分子,广泛分布于各类上皮细胞间介导同型细胞间连接的、具有钙依赖性的粘附分子,其在胚胎发育、形态发生、上皮极性和完整性等方面起到重要作用[5]。其表达程度及功能活性状态直接影响细胞的脱落和再粘着,对维持组织结构的完整性、极性及细胞分化等起重要作用[6]。其表达下降时细胞的粘附作用减弱,使肿瘤细胞发生浸润和转移[7]。

本研究表明,E-Cadherin在高分化型结直肠癌的表达明显高于未分化型的结直肠癌,提示E-Cadherin与肿瘤的分化有关,可作为分子标记物来鉴别肿瘤的恶性程度。本组资料显示E-Cadherin的异常表达与结直肠癌的病理组织类型无明显相关性,主要考虑与各型腺癌结构的分化和异型程度不一致造成,例如管状腺癌就包括高、中、低分化三种类型。

多数学者认为E-Cadherin是肿瘤浸润抑制基因[8,9]。文献报道,结直肠癌E-Cadherin表达异常与肿瘤分化及浸润深度密切相关,与本研究发现一致。可见E-Cadherin可以作为大肠癌的标志物,协助判断大肠癌的预后。

研究证明,淋巴结微转移与患者预后直接相关。CK20是一种独特的I型细胞角蛋白,为具有严格的上皮特异性的癌细胞标志物,可稳定地存在于几乎所有的胃肠道癌及其转移癌中,正常血液及淋巴结的固有成分如淋巴细胞、内皮细胞一般不表达,是检测直肠癌微转移较特异的指标[10,11]。我们应用RT-PCR检测CK-20阳性率为(55.8%),而传统病理切片诊断为淋巴结转移的阳性率为(45.5%),两组间有显著性差异(P<0.001)。

11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(54.5%)E-Cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例(6.67%)表达阴性,两者差异有统计学意义(P=0.041)。本研究提示E-Cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。

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