1材料与方法

1．1材料

1．1．1质控菌株

金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽胞杆菌［CMCC(B)63501］、大肠埃希菌［CMCC(B)44104］，均由中国食品药品检定研究院提供。

1．1．2培养基

营养琼脂培养基、硫乙醇培养基、改良马丁培养基、玫瑰红钠琼脂培养皿、麦康凯(MaC)琼脂培养基、酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂(TSA)培养皿、沙氏(SDA)培养皿，均由兰州生物制品研究所有限责任公司培养基室提供。

1．1．3主要试剂和仪器

革兰染色液购自美国BD公司;威泰科GP(革兰阳性)鉴定卡、GN(革兰阴性)鉴定卡、BCL(芽胞杆菌)鉴定卡、YST(酵母)鉴定卡、0．45%氯化钠注射液，均购自法国生物梅里埃公司;VITEK2Compact微生物检测系统，购自法国生物梅里埃公司;迅数菌落分析—显微成像一体机，购自杭州迅数科技公司;HPY-300微生物限度过滤系统，购自杭州泰林医疗器械有限公司;麦氏浊度比浊仪，购自法国生物梅里埃公司。

1．2方法

1．2．1质控菌株传代

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌和大肠埃希菌的冻干菌粉安瓿掰开，用无菌吸管吸取0．5～0．8mL的营养肉汤培养基，滴加到安瓿中，轻轻旋转安瓿并吹打，使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。然后将其新鲜培养物接种至营养琼脂培养基中，于30～35℃培养18～24h传代(不超过5代);将传代适应的(不超过5代)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌及大肠埃希菌的新鲜菌落(放置时间不超过24h)，用VITEK2compact进行鉴定分析。

1．2．2纯菌鉴定

将用于生产和科研的鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、肺炎链球菌、沙门菌等的传代菌株培养物新鲜样本291个进行菌型鉴定，根据可信度结果作为考察其稳定性的一个指标。

1．2．3样品的采集与制备

主要采集2010—2013年的人员及设备表面微生物、沉降菌、浮游菌及微生物限度样品共313个。①人员:压指试验、表面接触(头、胸、手腕、肘、膝盖)平皿;②设备:表面擦拭;③环境:沉降菌(A级、B级、C级、D级)、浮游菌(A级、B级)。将所有阳性平皿送菌型鉴定;④微生物限度:将生产科室的注射用水和纯化水系统水点每周取样一次，按照中国药典规定的微生物限度检测标准操作细则进行。

1．2．4环境微生物菌型检测

将所培养的单颗菌落或纯分的菌落进行菌落特征观察，经革兰染色，鉴别其是革兰阳性杆菌或是球菌、革兰阴性杆菌或球菌，选用适宜的鉴定卡。然后按照VITEK2Com-pact全自动微生物分析系统仪说明书中的标准操作流程进行测定，一般2～10h给出鉴定结果。

1．2．5菌型结果判断标准

VITEK2Compact微生物检测系统的生化鉴定是根据不同微生物的理化性质，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果，一旦鉴定卡内的终点指示孔到达临界值，则表明此卡已完成鉴定。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值(%)，按此值的大小对检测可信度作出评价。可信度96%～99%为极好，95%～92%为较好，91%～89%为好，88%～85%为可以接受，85%以下的可信度为低分辨率的鉴别。对于只鉴定到属的菌株，还需根据报告提示信息进行补充试验，进一步鉴别到种。

2结果

2．1质控菌株检测分析

用VITEK2Compact微生物检测系统对已知的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌共4株标准菌株作为质控菌株进行检测，结果与已知完全相符，可信度在97%以上。

2．2纯菌鉴定2010—2013年纯菌鉴定样本291个，

2．3环境微生物数据库的建立

通过对所收集的环境及制品染菌共313个样品(其中人员及设备表面微生物25个;沉降菌228个;微生物限度66个)的检测结果进行整理和分析。共检出微生物268株，其中人员及设备表面微生物18株;沉降菌188株;微生物限度62株。

2．4不同样品菌型鉴定结果

对环境检测样品(人员及设备表面微生物和沉降菌)及微生物限度样品检出微生物的趋势。结果分析:①人员及设备表面微生物主要以沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌和玫瑰库克菌等革兰阳性菌为主，占72．2%以上，其次是鲁氏不动杆菌和少量巨大芽胞杆菌等;②沉降菌样本以革兰阳性球菌居多，主要为葡萄球菌属，藤黄/里拉微球菌，玫瑰库克菌等，占检出菌的69．7%，而以少动鞘氨醇单胞菌为主的革兰阴性杆菌次之，占23．9%。短小芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌等，革兰阳性芽胞杆菌出现频率较高为4．8%;③微生物限度检测样本以少动鞘氨醇单胞菌、代尔夫特食酸菌及鲁氏不动杆菌为主的革兰阴性杆菌，占检出菌的40．3%。其次为解甘露醇罗尔斯顿菌、皮氏罗尔斯顿菌均为革兰阴性短杆菌，占14．5%，霉菌检出率为9．7%。

3讨论

从菌型分析结果可知，生物制剂生产企业洁净区人员及设备表面微生物及沉降菌样品检出率最高的是革兰阳性菌，而居其首位的藤黄/里拉微球菌和葡萄菌属，此类菌种为洁净区环境及人员监测的主要菌群，环境中无处不在，主要存在于人体皮肤表面及呼吸道和口腔的分泌物，均为人员带入，应做好个人防护，树立无菌观念，从根本上降低污染的发生。沉降菌样品检出的短小芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌等，主要存在于土壤中，芽胞对热、干燥、辐射、化学消毒剂和其他理化因素有较强的抵抗力，一般常用的消毒剂很难去除，应选用特殊的强消毒剂。微生物限度所检出的解甘露醇罗尔斯顿菌、皮氏罗尔斯顿菌为革兰阴性短杆菌，有芽胞，好氧菌。因封闭的注射用水(80℃保温循环)和纯化水(20℃保温循环)经多重处理后微生物滋长的营养成分减少，在科室用水的定期微生物限度检查所出现的超标平皿，应做菌型鉴定并与环境检测结果作对比，寻找微生物的来源。另外，对于霉菌，从检出时间和企业所处地域分析，主要出现在湿度较大的南方地区，而对于空气相对干燥的西北地区霉菌的检出率更低，但也不容忽视。应对注射用水管道进行灭菌、纯化水管道消毒，并在春夏季节加强对各出水口的消毒处理。实验中是对生物制剂生产过程中微生物污染状况的初步探索，以法国生物梅里埃全自动微生物分析仪应用于生物制剂生产企业中日常环境微生物监控是十分必要的。该系统具有鉴定快速、准确、自动化程度高、操作简便、功能广泛等优点，尤其是GP卡和GN卡研究较为成熟，鉴定准确性最高，可进行快速鉴定。VITEK2Compact微生物检测系统鉴别含多种细菌的样本中的不同细菌时，需进行纯菌分离直至单颗菌落。革兰阴性菌，与革兰阳性菌在难于区分的情况下，可选择MaC琼脂作为纯化培养基;对于较难培养的菌株，也采用血平板进行纯培养。采集的环境微生物由于物理、化学的消杀或暴露了较长时间，菌株可能存在一定的损伤和变异，因此有必要对送检菌株进行复壮和再次纯化。通过菌型分析结果，能够发现生物制剂生产企业环境中微生物污染的一般规律，在现有环境检测微生物数据的基础上建立基因分型的数据库，可更好地应用于生产过程中的监控。

作者：房世娣赵小洁刘晓凡宣俊文钱秋娟马军兰魏然单位：兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心