本文作者：王航、孟春、石贤爱、郭养浩单位：福州大学生物科学与工程学院、福建省医疗器械和医药技术重点实验室

2-苯乙醇(2-Phenylethanol,PEA)是一种具有玫瑰香味的高级醇,香味淡雅细腻,香气轻柔甜和,在医药、食品、化妆品、烟草和日化用品等行业逐渐得到广泛应用,成为芳香族化合物中最重要的香料品种。天然PEA香味纯正,无不良副产物,日益受到消费者青睐,其市场价格远高于化学合成的PEA[1]。利用酵母催化L-苯丙氨酸(L-Phe)生成PEA是工业化生产天然PEA的有效途径。目标产物PEA对酵母的抑制效应远大于副产物乙醇,是PEA生物合成过程主要瓶颈。了解PEA对酵母的胁迫机制及酵母的抵抗机理有助于深化对酵母合成PEA过程的认识,为解除PEA抑制效应提供依据。有机溶剂对酵母细胞作用位点众多,细胞对环境胁迫作用的抵抗机制也十分复杂,至今仍未完全弄清楚。醇对酵母胁迫的研究多集中于乙醇,对PEA的研究较少见。流式细胞术可在单细胞水平对群体细胞进行分析,具有分析速度快、灵敏度高、测量指标多、信息量大等优点,是进行细胞生理生化特性研究的有力工具。利用流式细胞术对PEA作用后酵母细胞生理生化特性变化进行研究,未见相关报道。本文研究在不同浓度PEA作用下,酵母分解代谢能力、细胞形态、细胞膜渗透性、胞内ROS浓度、线粒体膜电位、关键酶基因的表达等生理生化特性的变化规律,为优化PEA生物合成过程提供重要依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种:酿酒酵母R-UV3由本实验室选育[2]。1.1.2主要仪器:荧光定量PCR仪(ABIPrism7500),AppliedBiosystems公司;透射电镜(JEM1010),JEOL公司;流式细胞仪(CoulterEpicsXL),BechmanCoulter公司;冷冻离心机(Z323K),Hermle公司。1.1.3主要试剂:碘化丙啶、罗丹明123和二氢乙啶(98%),Sigma公司;TRIZOL试剂,美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒,TaKaRa公司;荧光定量PCR试剂盒(SYBRGreen),AppliedBiosystems公司。1.1.4培养基:①种子培养基(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,酵母浸粉10.0,pH5.0;②糖代谢测试培养基(g/L):葡萄糖10.0,KH2PO41.0,脲2.0,MgSO40.3,CaCl20.2,pH5.0;③分批转化培养基(g/L):葡萄糖60.0,KH2PO41.0,脲1.0,L-Phe10.0,MgSO40.3,CaCl20.2,pH5.0。

1.2方法

1.2.1种子培养:从斜面接种至装有25mL种子培养基的250mL摇瓶中,30°C下250r/min振荡培养1214h至对数期。

1.2.2酵母PEA处理方法:收集对数期酵母种子,以0.6%(干重)接种量接入装有25mL分批转化培养基的250mL摇瓶中,30°C、250r/min振荡培养18h,离心收集菌体,无菌水洗涤2次后,转接入装有25mL含PEA培养基的250mL摇瓶中,每小时补加0.25g葡萄糖溶液(50%,W/W),30°C、250r/min培养24h。

1.2.3糖代谢保留值测定:见文献[2]。

1.2.4碘化丙啶染色:离心收集经PEA处理24h的酵母细胞,用PBS洗涤2次后稀释至107个细胞/mL,取100μL细胞加1μL2.5mg/L的碘化丙啶,37°C避光孵育50min,加900μLPBS,混匀,流式细胞仪检测(激发光488nm,FL3检测器测605635nm发射光强度),计数10000个细胞。

1.2.5二氢乙啶染色:离心收集经PEA处理24h的酵母细胞,用PBS洗涤2次后稀释至107个细胞/mL,取100μL细胞加900μL含0.01%十四烷基三甲基溴铵的PBS和1μL30mg/L的二氢乙啶,37°C避光孵育30min,流式细胞仪检测(激发光488nm,FL3检测器测605635nm发射光强度),计数10000个细胞。1.2.6罗丹明123染色:离心收集经PEA处理24h的酵母细胞,用PBS洗涤两次后稀释至107个细胞/mL,取100μL细胞加900μLPBS和2μL1mg/L的罗丹明123,37°C避光孵育20min,流式细胞仪检测(激发光488nm,FL1检测器测505545nm发射光强度),计数10000个细胞。

1.2.7透射电镜观察:离心收集经PEA处理24h的酵母细胞,每107个细胞加入1mL的4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定液,4°C下固定3d后,委托福建医科大学电镜实验室制成50nm薄切片,使用透射电镜进行观察,电压80kV。

1.2.8aro10基因相对表达量检测:取1mL酵母细胞(约108个),离心去上清,加入1mL1%蜗牛酶液和20μL5%二硫苏糖醇溶液,37°C振荡脱壁30min。4°C、1000×g离心10min去除上清液,加入1mLTRIZOL试剂,按文献[3]提取RNA。按逆转录试剂盒说明书将提取到的RNA逆转录成cDNA。利用SYBRGreen试剂盒进行实时荧光定量PCR检测,PCR引物见表1。PCR反应参数设置见表2。每个样品做4个重复样,以actin为内对照,ΔCt=aro10的平均Ct–actin的平均Ct;以不加L-Phe组为阴性对照,ΔΔCt=样品组ΔCt–不加L-Phe组ΔCt,以2ΔΔCt表征aro10基因的相对表达量。

2结果与讨论

2.1PEA对酵母糖代谢活性的影响分解代谢是细胞生理活动的基础。酵母细胞的糖代谢活性可表征其生理生化状态及生物活性。测定了外加不同浓度PEA作用24h后酵母的糖代谢保留值,结果见图1。酵母糖代谢保留值随PEA浓度增加而降低,在PEA浓度超过2.4g/L后,下降趋势变得更加显著,PEA浓度大于3.0g/L后,下降趋势又有所趋缓。在4.0g/LPEA作用后,糖代谢保留值仍有0.43,说明此时酵母还未完全死亡,仍有分解代谢能力。

2.2PEA对酵母细胞形态的影响酵母分别经0、2.7和4.0g/LPEA作用24h后,切片做透射电镜观察(图2)。图2A是未经处理的酵母细胞,其细胞壁与细胞质界限清晰,内部结构完好可见,外形圆滑。图2B是经2.7g/LPEA作用的酵母细胞,与图2A所观察到的细胞无明显差别。图2C和2D是经4.0g/LPEA作用的酵母细胞,细胞内部结构变得模糊不清,细胞质染色明显变浅,可能是因为细胞膜渗透性增强,胞内物质大量外漏。

2.3PEA对细胞膜渗透性的影响细胞膜是隔离胞内外物质的天然屏障,细胞膜渗透性的增强会导致胞内重要物质泄露,从而使细胞失去活性[4]。以碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)为染色剂,用流式细胞仪测定了经不同浓度PEA作用24h后细胞膜渗透性的变化,结果见图3。由图3可知,当外加PEA浓度小于0.8g/L时,绝大多数酵母细胞的荧光值小于1,未被PI渗透,说明绝大多数细胞的细胞膜完好。随着外加PEA浓度增加,荧光值大于1的细胞越来越多,说明越来越多细胞的细胞膜受到破坏。特别是当外加PEA浓度由2.4g/L增加到3.0g/L,被PI渗透的酵母明显增加,而且荧光值较高的细胞也明显增多,说明细胞膜受损的程度明显加大。当PEA浓度大于3.0g/L后,在较弱的荧光区域分化出一个小峰,说明细胞群体产生了分化。

2.4PEA对细胞内ROS水平的影响活性氧簇(Reactiveoxygenspecies,ROS)是细胞代谢的副产物。ROS浓度过高,会氧化核酸、蛋白质、脂肪等生物大分子,使其失去生物功能,从而抑制细胞活性。当细胞受到环境胁迫时,可能产生大量的ROS,从而诱导细胞凋亡[5]。以氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)为染色剂,用流式细胞仪测定了经不同浓度PEA作用24h后细胞内ROS水平,结果见图4。由图4可知,随着PEA浓度增加,产生较强荧光的细胞数逐渐增加,同时峰形也向荧光值高的方向偏移,说明越来越多细胞的ROS浓度增加了。PEA浓度从1.6g/L增加到2.4g/L时,ROS急剧增加,PEA超过3.0g/L后,ROS浓度反而下降,这可能是由于细胞受到越来越大的伤害,产生ROS的能力反而下降。

2.5PEA对线粒体膜的影响线粒体是真核细胞中的重要细胞器,在细胞凋亡过程中起重要作用。线粒体功能在增强酵母细胞对乙醇耐受性上起十分重要的作用[6]。以罗丹明123(Rhodamine123,RH123)为探针,用流式细胞仪测定经不同浓度PEA作用后酵母细胞线粒体膜电位,结果见图5。由图5可知,随着PEA浓度增加,在荧光值较高区域逐渐出现新细胞峰,峰的数量也逐渐增多,说明细胞种群呈分化趋势,特别是PEA超过3.0g/L后,出现了几个荧光值较高的峰,细胞种群明显分化。当PEA度超过3.5g/L后,高荧光值细胞急剧增多,说明大量细胞线粒体膜电位显著增大。线粒体膜电位增大说明泵出线粒体膜的质子多于流回基质的质子,而质子的泵出在分解代谢过程产生,质子的流入由合成代谢介导,因而线粒体膜电位增大反映分解代谢水平超过合成代谢,二者解偶联。Stark等[7]观察到随着外加PEA浓度的升高,细胞比耗氧速率增加,而细胞对糖得率却下降,从动力学角度为PEA导致细胞分解代谢和合成代谢解偶联提供了证据。许多研究表明,细胞线粒体膜电位升高往往导致ROS浓度升高[8]。

2.6PEA对aro10基因表达的影响苯丙酮酸脱羧酶是L-Phe生成PEA途径中的关键酶之一,aro10是酿酒酵母中编码苯丙酮酸脱羧酶的主要基因[9]。将酵母细胞在含1%L-Phe的PEA培养基培养3h后,测定aro10基因相对表达量,结果见图6。PEA的加入降低了aro10的表达,在PEA浓度达到2.4g/L后表达水平急剧下降,PEA浓度超过3.0g/L,aro10的表达逐渐回到不加L-Phe的水平。aro10相对表达量随外加PEA浓度的变化关系与qPhe随PEA浓度的变化趋势[10]很相似,可见,PEA抑制L-Phe转化的重要机理之一,是PEA抑制aro10基因的转录。由于苯丙酮酸脱羧酶受L-Phe诱导,因而PEA导致aro10基因表达水平下降的原因可能是PEA抑制了L-Phe的摄入。综上,当PEA浓度由2.4g/L增加到3.0g/L,R-UV3酵母的分解代谢能力、细胞膜渗透性、aro10基因表达水平等生理生化特性都发生较为显著的变化,从而导致生物转化活性急剧下降[10]。从补料分批转化过程[10]来看,当反应液中PEA浓度超过3.0g/L后,PEA的增长明显变慢,也印证了这一敏感区间的存在。PEA对酵母细胞作用规律的研究结果不仅具有理论意义,而且对实施产物原位转移(InSituProductRemoval,ISPR)过程中水相PEA浓度控制具有实际指导作用。在ISPR过程中,通过有效控制水相PEA浓度,可令酵母细胞保持较大的催化活性,从而提高时空得率。根据本文研究结果,ISPR过程水相PEA浓度可考虑控制在2.43.0g/L。