本文作者：赵婷、姚粟、李辉、薛强伟、程池单位：中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心、山东优福虫草素生物科技有限公司

蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)为天然冬虫夏草(Cordycepssinensis)中分离到的内寄生菌,其菌丝体发酵物具有广泛的药理活性,如降血脂、止咳祛痰、镇静、解痉等[1]。蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)已列入卫生部(2001)84号文件《可用于保健食品的真菌菌种名单》。目前,已实现蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)发酵法生产菌丝体作为冬虫夏草药材的替代药品或保健品[2]。2010年新版GMP实施后,为加强保健食品生产管理,国家食品药品监督管理局(SFDA)于2011年9月了《保健食品良好生产规范(修订稿)》征求意见稿,生产企业进行保健食品产品申报时,应遵循:“菌丝体原料、益生菌类原料和藻类原料采购应当索取菌株或品种鉴定报告、稳定性报告和不含耐药因子的证明材料。”其中,药敏试验的要求是从微生物菌种或其代谢产物的食用安全方面考虑,以避免外源耐药因子带入体内而引起耐药性。然而,对于产孢丝状真菌的药敏检测,尤其是应用于保健食品产业的产孢丝状真菌,目前国内缺乏相关的检测方法、标准及检测机构,本文参照美国国家临床实验室标准化委员会(CLSI)M38-A2《肉汤稀释法抗真菌药敏试验参考方案》[3]对蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)进行了药敏检测,期望为相关检测方法及标准的建立提供部分技术依据,进而更好地服务于广大保健食品生产企业。

1材料

1.1试验菌株蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali),由山东优福虫草素生物科技有限公司提供。

1.2质控菌株滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)AS2.1846T=ATCC22019T,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.3抗真菌药物试验所用6种抗真菌药物,均购自中国食品药品检定研究院,配制成储存液置20°C备用,相关信息见表1。

1.4培养基及试剂RPMI-1640液体培养基(含谷氨酰胺,不含碳酸氢盐,含酚红作为pH值指示剂),购自美国ThermoFisher公司;沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA),马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),购自北京陆桥技术责任有限公司;三氮吗啉丙磺酸(MOPS),购自美国Amresco公司;96孔灭菌酶标板购自美国Costar公司。

2方法

2.1微量药敏板制备抗真菌药物按照使用说明操作,直接或80°C干燥至恒重后,称量0.0160g伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、环吡酮胺,分别溶于10.0mLDSMO中,配制成1600mg/L的存储液,称量0.0512g5-氟胞嘧啶、氟康唑,分别溶于10.0mL无菌蒸馏水中,配制成5120mg/L的存储液,置20°C储存备用。用DMSO将非水溶性药物储存液按1:50稀释至2倍终浓度,即伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、环吡酮胺为32mg/L,用RPMI-1640液体培养基(以终浓度为0.165mol/L的MOPS为缓冲液,25°C调节pH7.0)将水溶性药物储存液按1:40稀释至2倍终浓度,即5-氟胞嘧啶、氟康唑为128mg/L。取无菌96孔酶标板,在第1孔加入稀释后的抗真菌药物200μL,第212孔加入RPMI-1640培养基100μL。从第1孔吸取100μL药液加入第2孔,充分混匀后吸取100μL加入第3孔,依次做倍比稀释至第12孔,第12孔的药液混匀后吸取100μL弃去。配置好的药敏板从第1孔至第12孔药物浓度由高到底为320.0156mg/L或1280.0625mg/L。另设空白对照及未加药物的生长对照,非水溶性药物对照中加入1μLDSMO。

2.2供试菌株孢子悬液制备将供试菌株蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上25°C培养710d,用1mL无菌0.85%生理盐水冲洗孢子,转入无菌试管,静置5min,取上部均质孢子悬液于另一无菌试管,涡旋振荡15s,用分光光度计校正孢子悬液浓度至(0.45.0)×104CFU/mL(波长530nm时,OD值为0.090.13)。

2.3孢子悬液浓度质控验证将蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)孢子悬液梯度稀释后,取0.01mL涂布于沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)上,25°C28°C培养15d,菌落计数以验证孢子悬液浓度。

2.4接种在96孔板的112列孔每孔加入100μL的孢子悬液,25°C静置培养,48h后观察结果。

2.5MIC(最低抑菌浓度)值判读伊曲康唑、伏立康唑MIC值为肉眼观察100%抑制生长的药物浓度;环吡酮胺MIC值为肉眼观察80%及以上抑制生长的药物浓度;氟康唑、酮康唑MIC值为肉眼观察50%及以上抑制生长的药物浓度;5-氟胞嘧啶没有规定,暂定MIC值为肉眼观察50%及以上抑制生长的药物浓度[45]。试验菌株均做2次重复,试验结果由至少2人共同判读,以保证结果的准确性。

3结果

3.1方法质控6种抗真菌药物对质控菌株滑假丝酵母(C.parapsilosis)ATCC22019T的MIC值检测结果见表2,质控菌株MIC检测值均在参考范围之内,表明实验操作及结果可信。

3.2接种量经分光光度计测定,试验菌株蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)孢子悬液在波长530nm时OD值为0.09,经平皿菌落计数验证,孢子悬液浓度为1.1×104CFU/mL,两者结果相互吻合。3.3MIC值判读6种抗真菌药物对蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)的MIC值检测结果见图1,试验菌株除5-氟胞嘧啶外,其他药物MIC值拐点均落于设定的药物浓度范围之内,5-氟胞嘧啶根据判读标准MIC值为≥128mg/L。图2给出了蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)在微量药敏板上25°C培养48h后的生长照片,直观地显示了供试菌株的生长情况,由于菌株生长代谢产酸,可以明显看出含酚红作为pH值指示剂的生长孔颜色变黄。CLSIM100-S21《抗微生物药敏试验参考方案21版》中规定了纸片扩散法及最低抑菌浓度稀释法对各类细菌的敏感(Sensitive)、中介(Intermediate)、抗性(Resistant)药敏判别标准;CLSIM27-A3《酵母的肉汤稀释法抗真菌药敏试验参考方案》中规定了假丝酵母属(Candidaspp.)及部分真菌的敏感(Sensitive)、剂量依赖型敏感(Sensitive-dosedependent)、中介(Intermediate)、抗性(Resistant)药敏判别标准。对于产孢丝状真菌,由于研究进展较缓慢,研究菌株的试验数据量较少,目前CLSI还未提出判别标准,仅对临床常用的几种药物给出了建议判别标准,但根据M38-A2方法可以得到相关MIC值,MIC值对于菌株的药物敏感性能描述也是重要的指征,并为今后判别标准的提出积累试验数据。本试验参照M38-A2方案步骤对试验菌株进行2次重复试验，所得MIC值结果基本相同,验证了M38-A2方案对于产孢丝状真菌药敏性能检测的可行性。CLSIM38-A2规定的培养温度为35°C,该培养条件可以促进产孢,但对于少数菌株培养条件可能存在差异,如供试菌株蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)在CLSI标准所述的35°C不生长,因此本试验采用25°C进行培养及药敏测试。另外,MIC值拐点的判读应以抑制菌体生长的最低浓度为标准,不应以pH值指示剂颜色的改变为标准,因为有些菌株伴随着代谢产酸带来的颜色改变,而另外一些代谢不产酸的菌株就不会发生颜色改变。

4讨论

对于产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案,美国临床实验室标准化委员会(CLSI)于1998年了M38-P,于2002年更新为M38-A,于2008年更新为M38-A2。M38-A2被检测真菌范围为包括临床常见侵袭真菌感染菌种的产孢丝状真菌,不包括非产孢丝状真菌,也不适应于双相真菌的酵母相。M38-A2与上一版比较,增加了棘白菌素类药物最低有效浓度(MEC,minimaleffectiveconcentration)的判别标准,增加了4种药物的结果判读及结果解释,抗真菌药物更新至14种,质控及参考菌株更新至13株[3]等。本文选取了14种抗真菌药物中的6种,该6种抗真菌药物国内有标准品提供,13株质控菌株中的1株,该株质控菌株国内有保藏,其他抗真菌药物及质控参考菌株都需要引进,然而相应的引进费用高昂、程序繁琐,是目前建立标准化方法亟待解决的问题之一。目前产孢丝状真菌抗药物敏感性试验研究主要集中在临床上[6],目的一般是研究开发具有广谱抗真菌性能的药物,或对抗真菌药物的抗菌谱进行监测[4,711]。以应用于保健食品的真菌为研究对象,测定其对不同抗真菌药物的敏感性,国内还未见报道,一方面也显示了国家政策文件与相关检测标准或方法不配套、不同步的矛盾。本研究期望对相关检测方法的建立提供部分技术依据,但由于受试菌株数量少,无法进行统计学分析,未来需要更多试验数据的积累,以获得菌株耐药敏感性的判别标准,最终服务于广大保健食品生产企业及检测机构。