本文作者：雷先德1,2李金文1徐秀玲1,2张翰林1,2曹林奎1作者单位：1.上海交通大学农业与生物学院2.农业部都市农业(南方)开放重点实验室

长期大量施用化肥、农药,导致土壤板结,易缺氧,土壤酶活性及微生物多样性降低。近年来,上海都市农业生产发展迅速,尤其是蔬菜生产,在实际生产中,大部分菜农为了片面追求高产而忽视品质,大量使用化肥,特别是氮肥的过量施用现象非常普遍。然而,近年来国家统计数据显示,我国农业资源消耗,包括化肥、农药等的用量增长速率与农业增产量不呈正比,并导致品质下降[14]。相关研究调查显示,这些化肥的利用率仅为35%左右,其余未被利用的大部分都变成了污染源,造成水体、空气和土壤污染等环境问题[58]。为了解决农作物高产与化肥过量施用而引起环境污染之间这一突出矛盾,农业部都市农业(南方)开放重点实验室开展了长期的农田污染源头控制与过程治理的研究工作,并且创新开发出了一种农用功能微生物菌剂。本试验以该微生物菌剂为试验材料,应用于叶菜类菠菜,探讨化肥减量化技术对菠菜营养吸收利用的影响,研究微生物菌剂对菠菜的促生效应,并应用PCR-DGGE(变性凝胶梯度电泳)等现代分子生物学的手段[89],研究化肥减量与微生物菌剂配施处理方式对土壤微生物种群多样性的影响,旨在为从源头控制农业面源污染,保护水源地生态健康,减少化肥用量,推广环保节能的农用混合微生物菌剂提供理论基础和试验参考。

1材料与方法

1.1供试材料与试验设计

供试菠菜品种为河北佳禾种子公司提供的大叶菠菜;供试菌剂由河北省科学院微生物研究所提供的硅酸盐菌剂和上海交通大学农业部都市农业(南方)重点开放实验室分离纯化培养的自生固氮菌液,二者进行混合培养而形成的混合菌液。该混合菌液具有溶磷、解钾及固氮等功能,主要菌株为Paenibacillusmucilaginosus和Bacillussubtilis,有效活菌数大于2×108cfu•mL1。选用直径30cm、高30cm的花盆。试验前每处理每盆等量施用30.55g有机肥,有机肥的有机质含量≥400g•kg1,N、P、K含量≥80g•kg1,含N43.6g•kg1,含水率27.55%,pH7.85,Cd含量7.23mg•kg1,Pb含量78.24mg•kg1,Cr含量116.43mg•kg1,As含量54.23mg•kg1。有机肥与土壤拌匀。本试验共设6个不同处理,每处理设3个重复(见表1)。菠菜定植密度为7株•盆1。试验所用氮肥为尿素,磷肥为过磷酸钙,钾肥为硫酸钾以及上海雨霖牌生物有机肥料。第1季菠菜从2010年11月20日播种开始,到2011年1月24日收割结束;第2季从2011年3月8日到2011年5月5日。供试土壤采自上海交通大学农业与生物学院试验田,土壤类型为褐壤土,试验前土壤理化性质背景指标测定如下:土壤全氮、有效磷、速效钾、有机质含量分别为1.117g•kg1、0.212mg•kg1、125.00mg•kg1、12.40g•kg1,电导率(Ec值)为1.84mS•cm1,pH为7.25。试验期间人工浇水,根据菠菜不同生长期的需要,每1~5d浇水1次。

1.2菠菜测定分析

在第1季菠菜六叶期(2010年12月20日14:00)和营养生长后期(2011年1月24日14:00),每盆随机抽取3株,挑选每株新长出的成熟叶片,使用SPAD-502仪测定叶绿素含量SPAD1和SPAD2。2011年1月14日下午,用OSI-FL叶绿素荧光仪、经暗适应30min后,测定菠菜叶片叶绿素荧光参数,每处理9次重复。2011年1月24日,菠菜收割当天,用紫外分光光度法测定菠菜可食部分硝酸盐含量,每样品3次重复。电子天平计量菠菜收割产量,每盆单独收割测产;菠菜N、P、K含量由上海交通大学分析测试中心测定,其中N使用Elementer公司元素分析仪(EAI)测定,P、K使用离子光谱仪(ICP)分析测定,每个样品3次重复。

1.3土壤样品采集与处理

试验期间,分别在菠菜六叶期(2010年12月20日)和营养生长后期(2011年1月24日)两次采集土样。使用不锈钢取土器采集0~15cm土层,部分土壤放于20℃冰箱冷冻保存,另一部分土壤样品风干后研磨,分别过2mm筛和0.45mm筛,塑料袋封装保存,待测。

1.4土壤微生物分析

1.4.1土壤总DNA的提取、16SrDNAV3区片段PCR扩增

每个样品取0.5g土样提取DNA,本试验采用Omega公司生产的soilDNAKit提取土壤微生物基因组DNA,按试剂盒使用说明的操作步骤进行。将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板。采用微生物16SrDNA基因V3区具有特异性的引物对F341GC和R517,其序列分别为:（略）。GC夹(下划线)的目的是为了防止在DGGE过程中,引物的完全分离的扩增。反应体系为50μL,PCR反应采用降落PCR策略,即:预变性条件为96℃5min,前20个循环为94℃1min,65~55℃1min和72℃3min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃),后10个循环为94℃1min,55℃1min和72℃3min,最后在72℃下延伸7min。PCR反应的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2DGGE和染色

采用DcodeTM突变检测系统(CBS)对16SrDNAV3区扩增产物进行DGGE分析。使用梯度胶制备装置,变性剂浓度从30%到60%(100%的变性剂为7mol•L1的尿素和40%的去离子甲酰胺),聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%;在150V的电压下,上样量为18μL。其运行条件为:0.5×TAE电泳缓冲液,60℃电泳条件下,150V,10h。电泳完毕后,再用去离子水漂洗,固定15min,染色15min,显色10min。在图像处理过程中,对于在DGGE电泳图上是肉眼可见、但被软件忽略掉的一些小条带进行了手动处理,条带的密度由该软件自动算出。

1.4.3指纹图谱的处理与分析

基于PCR-DGGE的基本原理,所扩增的DGGE条带的数量可代表群落DNA序列的丰富度(S),群落DNA序列的多样性可采用Shannon-Weaver指数及其均匀度指数来表示,Shannon-Weaver指数及其均匀度指数计算公式为:（略）。

1.5数据统计分析

采用Excel2003及SPSS13.0进行数据处理及统计分析,用单因素方差分析及邓肯检验(DMRT)对数据进行显著性差异分析。采用Bio-rad公司Quantityone软件的UPGAMA程序进行微生物群落的聚类分析。

2结果与分析

2.1菌剂处理对菠菜生长特性和产量的影响

2.1.1对菠菜营养状态的影响

通过对菠菜叶片叶绿素含量进行测定结果显示(表2),不同施肥处理间差异明显。各处理相比,就两次测定的叶绿素含量的变化,T2、T3、T4、T5处理增幅较大,其中T1增加24.2%,而T5则达到45.6%。最后测定各处理的叶绿素含量差异为:T5>T4>T2>T3>T1>>CK。结果说明,化肥对叶绿素合成量的影响在菠菜生长前期影响更为明显,且常规化肥处理(T1)为最大;而在生长后期,随着微生物菌剂在环境中的定植与适应,在土壤中繁殖量显著提高,活性显著增强,对菠菜的作用逐渐显现,相反,化肥的作用却呈下降趋势,从而导致最终化肥减量20%和40%的处理比完全用化肥的叶绿素含量要高。可见,化肥作为速效性肥料对菠菜生长影响较快,作用时间较短,成本较高;而菌剂与化肥的混施,不但更能提高叶绿素含量,且作用时间长,成本也更低。Fv/Fm指标反映菠菜叶绿素荧光动力学参数,是叶片光合系统II原初光能转换效率,即可变荧光产量与最大荧光产量之比。测定结果显示,相比对照处理,使用菌剂的T2、T3、T4和T5处理的Fv/Fm都有所提高,其中T3达到0.797,比对照提高0.012,处理间差异显著。由此可见,菌剂处理的菠菜在营养生长中的光能转化能力优于不施肥CK。添加微生物菌剂的处理与纯粹使用化肥的T1处理差异不显著。菠菜对化肥及土壤中N、P、K等养分的吸收直接表现为各元素在植株体内的含量。由表2可知,在收割期,各处理间菠菜N含量存在显著差异。以T2和T3最高,T5和T4次之,CK处理最低,且T2处理较CK处理的增幅为100%。由此可见,菌剂处理后,固氮菌提高了植株N含量,也就是提高了N吸收,减少了N损失。菠菜收割后植株P、K含量以T1处理为最低,分别约为35.3g•kg1和56.5g•kg1,且明显低于CK的45.8g•kg1和69.9g•kg1,表明在生长后期,T1处理的菠菜对P、K的吸收较少,土壤中有效磷和速效钾含量低。相比T1处理,T2和T5处理反而有所提高,表明硅酸盐菌的溶磷、解钾作用促进了菠菜对P的吸收利用量,使菠菜P含量较纯化肥处理的T1要高。微生物菌剂的两种菌各自发挥了其主要功能,固氮菌保持了较低氮肥使用条件下的高N含量,硅酸盐菌确保了较低磷肥和钾肥使用条件下的高P、K含量。

2.1.2对菠菜硝酸盐含量的影响

收割后将菠菜全株(包括根、茎、叶)捣碎后测定硝酸盐含量。由表3可知,与不施肥(CK)处理相比,施肥处理对菠菜硝酸盐含量影响较大,使硝酸盐含量显著增加。其中,T1处理的硝酸盐增量最为明显,达到5866.52mg•kg1,T2最小,为4358.23mg•kg1,T3、T4和T5处理在4677.55~5078.25mg•kg1之间。由此可见,T2、T3、T4、T5处理与T1处理相比,硝酸盐含量明显降低。因此,菌剂的配合施用与纯施化肥相比,可以提高菠菜品质,有利于生产有机健康蔬菜。

2.1.3对菠菜产量的影响

根系是植物从土壤获取养分的必要器官,但作为可食用的菠菜,根系重量在菠菜收割期所占总生物量的比重越高(即根生物量比重越高),其可食用部分就相对减少,产量就相对降低。表3表明,固氮溶磷解钾菌剂配合施用后,与不施肥对照相比,根生物量比重有明显降低,由4.36%下降到3.02%,降低约30%,比化肥T1处理的3.54%也有降低。由此说明,功能菌剂的配施不仅促进了菠菜根系的生长,而且提高了养分及光合产物的有机分配,从而提高了菠菜可食部分的生物量比重,提高了菠菜产量,有效提高了菠菜的经济效益。本试验包括两季菠菜,产量计算为两季的总产量。其中,第1季为2010年冬季菠菜,第2季为2011春季菠菜。试验表明,菠菜产量受所施用肥料的影响较大,施肥对菠菜产量提高效果明显。由表3可知,不同处理间每盆菠菜的平均产量差异显著。与CK处理相比,T4处理的产量增加最大,每盆平均产量达到277.73g,产量增加170%;T3、T2、T5和T1处理的增产量依次减少,平均每盆产量分别为267.53g、264.38g、241.62g和220.13g。其中,化肥减量施用的T2、T3、T4和T5处理产量均比常规化肥用量T1处理产量高,达到了化肥减量而不减产甚至增产的效果。由此可见,菌剂可以替代部分化肥,减少农业化肥用量。

2.2菌剂处理对菠菜土壤微生物多样性的影响

2.2.1土壤微生物DGGE指纹图谱分析

对不同处理菠菜栽培土壤微生物16SrDNAV3可变区片断进行DGGE指纹图谱分析的结果(图1a)表明,不同施肥处理下盆栽菠菜土壤的微生物基因区系条带出现较小差别。与CK相比,各处理除T1外,条带亮度略有增加,条带数量无明显差别。从图1b16SrDNAV3区PCR扩增片段DGGE泳道图谱可以看出,多数的明显条带在迁移率上基本一致,说明不同处理间具有大量的共有微生物种群,这主要是存在于试验土壤中的土著微生物。微生物菌剂处理的明亮条带明显在图谱中部多出现1~2个条带,表明混合微生物菌剂与化肥的配施,提高了土壤主要微生物种群基因多样性和数量。由于试验在低温的冬春季进行,土壤微生物本身活性也较低,生长繁殖速率较慢,因而不同施肥制度对微生物种群与数量的影响反映不够明显。

2.2.2土壤微生物DGGE条带图谱的聚类分析

不同施肥处理间的土壤微生物种群相似性表现为DGGE条带聚类分析的相似性系数,相似性系数越高,种群多样性越趋于一致,如图2所示。本试验中,T4和T5处理间的土壤微生物种群相似性最高,达到0.80,被聚为一类,与T1处理的相似性系数为0.76,同时与CK都聚在一个大类;而T2和T3处理又被单独聚在一类,相似性系数为0.70;两个大类间最低相似性系数也达到0.65。一般认为相似值高于0.60的两个群体具有较好的相似性,将6个样品归为一类的相似值达0.65,说明种植1茬菠菜后,不同施肥制度的土壤细菌群落结构相似性程度提高。

2.2.3土壤微生物种群DNA多样性分析

对不同处理土壤的微生物16SrDNA的DGGE条带进行香农威尔多样性指数(Shannon-Wiernerindex)分析,结果见表4。从表4可以看出,丰富度指数以T1处理最低,T3处理最高,与不施肥处理CK相比,常规化肥处理T1的土壤细菌丰富度指数有所降低,而添加微生物菌剂的则有所提高;而Shannon-Wierner指数在各处理间差异较为明显,与不施肥处理CK相比,常规化肥处理T1的土壤细菌多样性有所降低,而添加微生物菌剂的各处理却有明显提高。该结果表明,常规化肥处理不利于提高土壤微生物种群多样性;相反,在化肥减量情况下,配施有益的微生物菌剂,有利于改善土壤中主要微生物种群结构,提高微生物种群多样性。

3讨论与结论

本研究中,施用微生物菌剂显著提高了菠菜叶绿素含量,以T5和T4处理最好;显著提高了菠菜对NPK养分的吸收与转化,以T5和T2处理最好;而对叶绿素荧光参数作用不明显;菠菜硝酸盐含量为常规化肥处理>化肥减量20%处理>化肥减量40%处理>不施肥CK处理。微生物菌剂部分替代化肥引起菠菜硝酸盐含量减少,从而提高了菠菜品质。土壤中有效氮、磷、钾养分的持续供给是影响菠菜营养生长阶段重要的因素[3],本试验中,微生物菌剂具有这方面功能。当环境中有效养分充足,菠菜生长期延长,长得更高更壮,最大限度地增加生物量,提高产量。本研究中菠菜产量以添加微生物菌剂并减少化肥用量40%的处理最好,各处理间差异显著。与CK相比,T4处理增产幅度最高,达到170%,与T1相比,也增产26.2%,这与前人的研究结论一致。崔美华等[910]研究表明,微生物菌剂对东北水稻的增产率达13.5%。这是因为微生物菌剂的有益菌群在土壤中定殖后,分泌有机酸可以溶解释放出被土壤颗粒等吸附的NPK养分,从而延长了土壤NPK养分的有效供给,促进了菠菜营养生长。可见,微生物菌剂应用的增产效果明显。

许多研究报道指出,土壤微生物群体变化与施肥类型和施肥用量有关[1113]。施无机肥对土壤微生物多样性及活性的影响,目前的尚有争议[1415]。并且,由于目前技术的制约,PCR-DGGE技术体系只能研究土壤中微生物量较大的种群,不能完全反映土壤中所有微生物种群数量。Sarathandra等[16]研究新西兰汉密尔顿的两个砂壤土试验区施肥对土壤微生物的影响,结果显示无机肥对土壤微生物群落有一定的影响。本试验中以T3处理土壤微生物多样性最好,丰富度指数为13、Shannon-Wierner指数为0.983,常规化肥处理(T1)最差,与Sarathandra等[16]的研究一致。表明微生物菌剂能够保持和提高土壤微生物丰富度指数和香农威尔(Shannon-Wierner)多样性指数,稳定农田土壤环境中微生物种群多样性;常规化肥处理导致土壤微生物种群多样性的降低。值得注意的是,本研究各处理的生物种群丰富度均不高,与Duan等[17]研究结果有一定差异。此外,土壤温度、有机质含量也是影响微生物种群数量的重要因素,温度太低、有机质过少都不利于微生物增殖与外来种的定植[18]。由于农田土壤环境中微生物种群多样性受试验田长期试验、土壤有机质较少、试验环境温度低的影响,各试验结果的总体物种丰富度不高。鉴于此,以后可选择固定试验田或土壤中进行长期试验,进一步研究长期稳定施肥处理条件下微生物菌剂对土壤微生物多样性的影响。