【摘要】目的：观察新辅助化疗对乳腺癌外周血微转移因子的影响。方法：以48例具备新辅助化疗条件的乳腺癌患者为研究对象，采用RTPCR技术，联合检测外周血中CK19mRNA、VEGFmRNA和hMAMmRNA的表达，观察新辅助化疗前后血微转移因子变化。结果：本组乳腺癌微转移因子阳性率在病理分级中差异无显著性意义(P>0.05);在分期中，分期越高阳性率越高(P<0.05);化疗方案可影响微转移因子阳性率的变化(P<0.01)。结论：通过检测乳腺癌患者外周血中微转移因子，有可能成为判断乳腺癌预后和指导治疗的指标。

【关键词】乳腺癌新辅助化疗微转移因子逆转录聚合酶链反应

NeoadjuvantChemotherapyforPeripheralBloodMicrometastasisFactorsinPatientsofBreastCancerHEGang,etal.NingboNo.2Hospital,Ningbo(315010),China

AbstractObjective:Toexploretheinfluenceofneoadjuvantchemotherapyonperipheralmicrometastasisfactorsinbreastcancer.Methods:CK19mRNA,VEGFmRNAandhMAMmRNAinperipheralbloodof48breastcancerpatientsweredetectedusingRTPCRbeforeandafterneoadjuvantchemotherapy.Results:Nosignificantdifferenceinthebreastmicrometastasisfactorswasnotedindifferentpathologicalstages(P>0.05);thepositiverateofmicrometastasisfactorswashigherinupperclinicalstages(P<0.05).Chemotherapyhadpositiveeffectonmicrometastasisfactors(P<0.01).Conclusion:Thefactorsofperipheralmicrometastasiscouldbetestedforbreastcancerpatients,guidingprognosisandtreatment.

Keywordsbreastcancerneoadjuvantchemotherapymicrometastasisfactorreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)

肿瘤对化疗药物的敏感性一直是近年研究的热点。NSABPB18试验随访5年的资料证实[1]，检测外周血微转移肿瘤细胞，并选择有效药物进行治疗，是新辅助化疗亟待解决的问题。笔者选择细胞角蛋白19(CK19)、血管内皮生长因子(VEGF)和人乳腺球蛋白(hMAM)作为乳腺癌外周血微转移因子进行联合检测研究，探讨新辅助化疗对微小转移灶检测的方法和临床意义。

1临床资料

选择2006年4月～2009年3月具备新辅助化疗条件的乳腺癌患者48例，年龄35～78岁，平均47.6岁。病理分期：I～II期17例，III期31例;病理分级：浸润性低分化腺癌27例，浸润性中、高分化腺癌21例。

2方法

2.1新辅助化疗方法48例采用CAF方案行新辅助化疗23例，予环磷酰胺600mg,第1天，氟尿嘧啶500mg,第1天，多柔比星60mg,第1天，两周方案;第1天采用AT方案行新辅助化疗25例，予紫杉醇160mg，第1天，表柔比星60mg，第1天，两周方案。分别于新辅助化疗前第1天和化疗结束后第7天检测外周血中相关基因标志物微转移因子的表达水平。48例患者之前均未行任何治疗。

2.2检测方法化疗前和化疗后分别取外周静脉血10ml，弃去采血针抽取的前2ml血，以减少标本被皮肤细胞污染可能，随后取8ml分别加入四支含EDTA的抗凝管中，充分摇匀，以PBS稀释后，采用淋巴细胞分离液离心，收集淋巴细胞和单核细胞层，洗涤后移至EP管，70℃冻存备提取RNA用。

2.2.1仪器、试剂与引物PersonalCycler型PCR仪(德国Biometra公司);GelDoc型凝胶成像分析系统(美国Biorad公司);RNA提取试剂盒和RTPCR试剂盒(Takara公司);引物(上海英骏生物技术有限公司)。VEGFC上游引物：5’GCATGAACACCAGCACGAG3’;下游引物：5’ATGAAGGGACACAACGACAC3’，扩增产物为717bp片段。CKl9上游引物：5’GCGACTACAGCCACTACTACAC3’;下游引物：5’GAACCAGGCTTCAGCATCC3’，扩增产物为440bp片段。11MAM上游引物：5’CCGACAGCAGCAGCCTCAC3’;下游引物：5’TCCGTAGTTGGTTTCTCAC3’，扩增产物为338bp片段。内参照βactin上游引物：5’AGAAGGATTCCTATGTGGGCG3’;下游引物：5’AAGCATTTGCGGTGGACG3’，扩增产物为979bp片段。

2.2.2RNA提取及鉴定取出保存的单核细胞标本，按RNA提取试剂盒中的操作说明书提取总RNA，并根据(A260A320)×稀释倍数×0.04μg/μl值计算RNA的浓度，以A260/A280判定其纯度。

2.2.3RTPCR反应按照RTPCR试剂盒操作，βactin分别与VEGF、CK19和hMAM进行同管扩增，PCR产物用1%琼脂糖电泳后，进行凝胶成像分析，并根据VEGF/βactin、CKl9/βactin和hMAM/βactin分别计算各自的相对表达量。

2.2.4产物鉴定凝胶成像系统观察，本组VEGF、CK19和hMAM均在内参照扩增产物片段处出现清晰条带，证实RNA无降解和反应体系适当。各自对应的预期产物片段出现清晰阳性条带为待测标本阳性，否则为阴性。本组扩增产物在相应扩增产物片段处显示清晰阳性条带。

2.3统计学分析应用SPSSl5.0统计软件，采用χ2检验及回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1化疗前微转移因子测定低分化腺癌微转移因子检测总阳性率85%(23/27)，其中hMAM阳性率51.8%，与VEGF和CK19阳性率比较差异有显著性意义(P<0.01);中、高分化腺癌检测总阳性率76%(16/21)。微转移因子阳性率在病理分级中差异无显著性意义(P>0.05)。病理分期Ⅲ期者微转移因子检测总阳性率87.1%(27/31)，明显高于I～II期的52.9%(9/17)，表明微转移因子与乳腺癌分期有关，即分期越高阳性率越高，两者比较差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。表1化疗前外周血微转移因子表达检测结果例

3.2新辅助化疗对微转移因子的影响见表2。表2化疗前后外周血微转移因子变化

4讨论

临床研究证实，乳腺癌是全身性疾病，血行播散是乳腺癌转移的途径之一，检测血循环中微转移因子并给予有效治疗是决定预后的重要因素。RTPCR是一种较为敏感的检测技术，能快速扩增肿瘤细胞内特异性的mRNA表达，并可在107个单核细胞检出1个克隆和10个乳腺癌细胞，其灵敏度可达(2～5)×107，并预示肿瘤的微小转移[2]。抽取外周血比抽取骨髓方便,且易被患者接受。笔者采用RTPCR技术以肿瘤特异性CK19、VEGF和hMAM为靶RNA，检测乳腺癌患者外周血微转移因子并结合新辅助化疗探讨其临床意义。

用于乳腺癌微转移指标的RNA主要有组织特异性mRNA，如细胞角蛋白19、血管内皮生长因子(VEGF)、多形上皮黏蛋白的核心蛋白、人乳球蛋白(hMAM)和癌胚抗原等[3]。联合其中的2～3项进行检测，可提高检出率，减少假阴性。因此，筛选乳腺组织特异性标志基因是提高微转移检测可靠性的关键。

本组结果显示，48例化疗前乳腺癌外周血中CK19、VEGF和hMAM表达总阳性率分别为为39.5%、47.9%和68.7%，其中低分化癌组中的hMAM阳性率为51.8%。文献报道[4],hMAM表达总阳性率为53.3%，VEGF在III期中的表达为35.5%。本组检出阳性率低于DeLuca等[5]报道的表皮生长因子受体mRNA在转移性肿瘤中的检出率59%。血液中阳性高度提示肿瘤组织中的表达，因此其有可能作为预后评价和辅助治疗选择(尤其针对表皮生长因子受体蛋白的单抗)及治疗监测的指标。Stathopoulou等[6]用RTPCR检测I、II期乳腺癌患者辅助治疗前外周血的CK19mRNA阳性率为30%(本组为29.4%)，认为CK19mRNA检出与无瘤生存率和总生存率相关，是判断预后的独立指标。张新丽等[7]对血液中检出微转移阳性率统计学分析，0～I、II、III期之间有显著差异(P<0.05)，显示血液微转移与肿瘤分期密切相关。本组结果显示，微转移因子阳性率在病理分级中无显著性差异(P>0.05)，而分期越高阳性几率越大，两者比较有显著性意义(P<0.05)。

笔者在对血液微转移因子检测的同时，选择了具有代表性的化疗方案和治疗周期。1994年美国FDA批准紫杉醇用于治疗复发转移的乳腺癌，2000年批准用于早期乳腺癌术后的辅助治疗。研究结果显示[8]，含紫杉醇组的5年无病生存率(DFS)和总生存率(0S)均有显著改善，复发风险降低17%(P=0.0023)，死亡风险下降18%(P=0.0064)，从而确定了紫衫醇在早期乳腺癌治疗中的地位。笔者选择经典的CAF和AT方案，实行2周给药，观察新辅助化疗后血液中微转移因子的变化。结果显示，化疗前微转移因子阳性率在化疗后均有不同程度降低。

化疗前后的分子生物学检测是反映肿瘤生物学特性的指标，化疗后这些指标可能发生变化。若在治疗前能获得这些生物学信息，对判定预后和拟订治疗方案至关重要[9]。随着检测药物疗效的生物学指标研究的深入，以及不断探索、开发有效化疗方案和药物，合理应用新辅助化疗这一手段，可为患者选择高效的个体化治疗方案提供可靠依据。

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3韩正祥，张敬川.hMAMmRNA和CEAmRNARTPCR检测乳腺癌外周血微转移.肿瘤，2004，24(3)：273275

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5DeLucaA，PignataS，CasamassimiA，etal.DetectionofcirculatingtumorcellsincarcinomapatientsbyanovelepidermalgrowthfactorreceptorreversetranscriptionPCRassay.ClinCancerRes，2000，6(4)：14391444

6StathopoulouA，VlachonikolisI，MavroudisD，etal.Moleculardetectionofcytokeratin19positivecellsintheperipheralbloodpfpatientswithoperablebreastcancer：evaluationoftheirPrognosticsignificance.JClinOncol，2002,20(16)：34043412

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8MamounasEP,BryantJ，LemberskyB，etal.PaclitaxelafterdoxorubicinPluscyclophosphamideasadjuvantchemotherapyfornodepositivebreastcancer：resultsfromNSABPB28.JClinOncol，2005，23(16)：36863696.

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