摘要:从木瓜中提取､分离､鉴定齐墩果酸｡方法:采取回流法､索氏提取法和冷浸法从木瓜中提取齐墩果酸,然后采用酸碱沉降法､氯仿萃取法分离纯化,并用高效液相色谱法进行鉴定｡结果:结果显示回流法提取效果最好｡结论:为齐墩果酸的工业化生产提供了一定的理论依据｡

关键词:木瓜;齐墩果酸;提取;分离;高效液相色谱法

0前言

木瓜,又称皱皮木瓜,铁脚犁,酸木瓜等,为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠的果实｡木瓜是具有食用,药用观赏的多用途植物,果实成熟后,色泽金黄,气味芳香,果实营养极为丰富｡齐墩果酸(Oleanolicacid),分子式为C30H48O3,是木瓜的主要有效成分,别名土当归酸,大部分以游离酸或糖苷的形式存在,为五环三萜类化合物,是我国首次从植物中发掘出来的,是治疗急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎比较理想的药物｡

本实验以干木瓜为原料,在单因素实验的基础上设计正交实验,优化提取齐墩果酸的最佳工艺条件｡通过酸碱沉降或氯仿萃取的方法分离纯化,最后经高效液相色谱法对其进行鉴定｡该种方法准确可靠,为初步研究建始木瓜中齐墩果酸提供试验基础,为齐墩果酸的工业化生产提供了一定的理论依据｡

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验原料

干木瓜片,粉碎机粉碎

1.1.2试验的主要仪器和设备

HHS型电热恒温水浴锅,RE52-99型旋转蒸发器,722可见分光光度计,紫外分光光度计,电子天平,分析天平,液相设备,分析柱:HypersilODS25μm｡

1.1.3试验主要试剂

95%工业酒精,分析醇的95%乙醇､甲醇､冰醋酸､高氯酸､浓硫酸､乙酸乙酯､香草醛,齐墩果酸标准品｡

1.2方法

1.2.1齐墩果酸提取方法的比较

(1)回流提取法:称取木瓜粉25g,分别用100ml,80ml,70ml的95%工业酒精在60℃下回流提取,时间依次为4,3,2小时,合并提取液,用乙醇定容至250ml,作为供试样｡

(2)索氏提取法:称取木瓜粉25g,用95%工业酒精在索氏提取器中提取,在90℃下至虹吸下溶液近无色(约8小时),将提取液转移至250ml容量瓶,定容至刻度作为供试样｡

(3)冷浸提取法:称取木瓜粉25g,用95%工业酒精150ml浸提一周,再用100ml乙醇浸提5天,合并浸提液,将提取液转移至250ml容量瓶,定容至刻度作为供试样｡

1.2.2比色法测定齐墩果酸的含量

精密称取香草醛0.3g,用移液管加入6ml冰醋酸,配置成5%香草醛-冰醋酸溶液｡分别取回流法,索氏提取法和冷浸法提取的样品0.01ml(每种做3个平行)加入试管中,加热挥发溶剂,试剂空白为对照｡精密加入新制的香草醛-冰醋酸0.2ml和高氯酸0.8ml,在70℃恒温水浴加热15分钟｡流水冷却至室温,精密加入乙酸乙酯4ml,摇匀,在波长560nm处测定吸光值,比较三种方法提取率｡

1.2.3回流提取的单因素实验

(1)温度对提取率的影响:分别称取10g木瓜粉,以95%工业酒精,料液比为1:15,按40,50,60,70,80℃五个温度梯度提取9h,提取3次,合并提取液,定容至250ml｡分别取0.01ml提取液加入试管中,通过比色法测定齐墩果酸的含量(每个样品3个平行)｡

(2)时间对提取率的影响:分别称取10g木瓜粉,以95%工业酒精,料液比为1:15,按3h,5h,7h,9h,11h五个时间梯度,置于60℃水浴锅,提取3次,时间间隔分别为1.5,1,0.5h;2.5,1.5,1h;3,2.5,1.5h;4,3,2h;4.5,3.5,3h｡合并提取液,定容至250ml｡分别取0.01ml提取液加入试管中,通过比色法测定齐墩果酸的含量(每个样品3个平行)｡

(3)料液比对提取率的影响:按料液比为1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,以95%工业酒精,置于60℃水浴锅中9h,提取3次,每次的溶剂用量为25,15,10ml;50,30,20ml;70,50,30ml;90,70,40ml;100,80,70ml｡合并提取液,定容至250ml｡分别取0.01ml提取液加入试管中,通过比色法测定齐墩果酸的含量(每个样品3个平行)｡

1.2.4正交试验优化回流提取的工艺

在单因素实验基础上,考察温度(A),提取时间(B),料液比(C)3个因素,每个因素3个水平,进行正交实验｡因素-水平表见表1-1所示｡

1.2.5齐墩果酸的分离纯化

(1)酸碱沉降法:准确称取4gNaOH固体,加入100ml水,配成1mol/ml的NaOH溶液｡量取10ml浓硫酸,将其缓慢倒入90ml水中,配成10%硫酸溶液｡取一份回流供试样将其旋转真空浓缩,浓缩成浸膏状物,回收乙醇,浸膏状物质用1mol/lNaOH溶液煮40分钟,趁热过滤,重复3次,合并滤液｡用10%硫酸溶液调pH=1,沸水浴4小时,氯仿萃取｡蒸馏回收氯仿,得固体齐墩果酸用甲醇定容至100ml｡

(2)氯仿萃取法:取一份回流供试样将其旋转蒸发,浓缩成浸膏状物,回收乙醇,所得浸膏状物质先后用水和氯仿洗涤,合并洗涤液,去水层,有机层用水洗涤6次,去水层,蒸馏氯仿,所得齐墩果酸用甲醇定容至100ml

1.2.6齐墩果酸的HPLC鉴定

(1)色谱条件:色谱柱为ODSC18色谱柱,柱温25℃,流速1ml/min,紫外检测波长215nm,流动相为甲醇:水:乙酸=90:10:0.1｡

(2)标准溶液的配制:准确称取10mg的齐墩果酸标准品,加甲醇溶解,置于10ml带刻度的试管中,配成1mg/ml的对照品溶液｡

(3)标准曲线的制作:用取样枪准确吸取0.1ml,0.2ml,0.3ml,0.4ml,0.5ml对照品溶液,加甲醇补充至10ml,混合均匀,得到浓度为0.01mg/ml,0.02mg/ml,0.03mg/ml,0.04mg/ml,0.05mg/ml的齐墩果酸标准溶液｡每次取20μl进样,测定其峰面积｡以齐墩果酸浓度(x)和峰面积(y)求回归方程｡

(4)精密度测定:取上述对照品20μl,重复5次进样,测定各自峰面积｡

(5)重复性实验:取同一样品平行制备5份供试品溶液,在上述同样色谱条件下分别进样20μl,测定其峰面积｡

(6)加样回收实验:准确量取已知含量的齐墩果酸样品溶液1ml,加入0.2mg的齐墩果酸标准品,做5个平行,在上述色谱条件下分别进样20μl,测定其峰面积｡

2结果与分析

2.1提取方法的比较

木瓜中齐墩果酸的提取法主要有回流提取法,索氏提取法,冷浸提取法等方法,三种提取方法中,回流提取的效果明显好于其他两种方法,索氏提取所需温度在80℃以上,可能会对齐墩果酸的结构造成破坏,而冷浸则提取温度相对较低,提取不完全,故而这两种方法的提取率低于回流法提取｡因此,本研究采用回流提取法进行下一步试验,并在单因素试验基础上,通过正交试验优化提取工艺｡

2.2单因素实验

2.2.1温度对提取率的影响

为了选择正交试验合适的温度条件,用95%的工业酒精,在相同的提取时间,料液比的条件下,对温度进行单因素试验,其提取率的变化情况在40℃-70℃范围内,随着温度的升高,分子的活性增大,扩散速度加快,浸出速度也加快,因此提取率升高,在70℃处为最大值,但是80℃时提取率有所下降,一方面可能是由于温度过高对齐墩果酸的结构产生破坏,另一方面则可能是因为温度过高引起乙醇的挥发,造成溶剂损失｡因此选定50℃,60℃,70℃作为正交试验的温度因素的三个水平｡2.2.2时间对提取率的影响

在相同的提取温度,料液比的条件下分别控制不同的提取时间,考察提取时间对提取效果的影响｡其提取率的变化情况显示:提取时间短则齐墩果酸来不及溶出,提取率较低,随着时间的延长,木瓜中齐墩果酸的提取率逐渐增高,其增长率分别为94.9%,9.5%,8.4%,1.7%｡由此可以看出,5h以后提取率的增长逐渐趋于缓和｡提取时间的延长虽然可以提高提取率,但是长时间的提取杂质的溶出率也会相应升高｡因此从经济高效等原因考虑,为节约时间､降低能耗,选择5h,7h,9h作为正交试验中时间因素的三个水平｡

2.2.3料液比对提取率的影响

在相同的提取温度,时间的条件下,分别选取不同的料液比,考察其对提取效果的影响｡其提取率的变化情况显示,

随着料液比的升高,由于溶剂的量的增加,其提取率也相应的不断增加,增长率分别为73.9%,37.7%,60.4%,4.9%｡由此可以看出,当料液比达到1∶20以后,提取率的上升趋势逐渐趋于平缓｡在实验条件范围之内,料液比1∶25时为最大提取率｡但是料液比不宜过多,否则不仅浪费溶剂,而且增加浓缩工作量｡因此选择1∶5,1∶20,1∶25作为正交试验料液比因素的三个水平｡

2.3正交实验优化提取工艺

以乙醇为溶剂的三因素三水平正交实验结果见表2-1,对表中齐墩果酸的提取率进行方差分析和显著性检验结果见表2-2｡正交实验和数据分析的结果表明,温度,时间,料液比对提取率影响的大小为温度>时间>料液比｡木瓜中齐墩果酸的最佳提取条件为A3B3C3即:温度70℃,提取时间9h,料液比1∶25｡

2.4高效液相色谱法鉴定齐墩果酸

用外标法对进行定量分析,标准品及标准品与回流提取纯化样品对比的HPLC图谱分别见图1､2､3｡经计算得木瓜中齐墩果酸的含量为1.28mg/g｡

色谱条件:ODSC18色谱柱,柱温25℃,流速1ml/min,紫外检测波长215nm,流动相为甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

色谱条件:ODSC18色谱柱,柱温25℃,流速1ml/min,紫外检测波长215nm,流动相为甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

1:齐墩果酸标准品2:氯仿萃取纯化样品

色谱条件:ODSC18色谱柱,柱温25℃,流速1ml/min,紫外检测波长215nm,流动相为甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

1:齐墩果酸标准品2:酸碱沉降纯化样品

2.4.1线性关系考察

如图4所示,以标准品的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得到回归方程y=4099733x+22375,r2=0.9918,结果表明齐墩果酸在0.01-0.05mglml与峰面积呈良好的线性关系｡

色谱条件:ODSC18色谱柱,柱温25℃,流速1ml/min,紫外检测波长215nm流动相为甲醇:水:乙酸=90:10:0.1

2.4.2精密度实验

用标准品溶液重复进样5次,每次进样20ìl,齐墩果酸峰面积值RSD为2.23%<5%,精密度良好｡

2.4.3重复性实验

取同一样品平行制备5份供试品溶液,在上述同样色谱条件下分别进样20ìl,测定其峰面积,所得RSD值为3.45%<5%,灵敏度良好｡

2.4.4加样回收实验

准确量取1.28mg/g的齐墩果酸样品溶液1ml,加入0.2mg的齐墩果酸标准品,做5个平行,测定其峰面积,经计算其平均加样回收率为97.8%,准确度良好

3讨论

3.1关于提取

有报道用氯仿,甲醇作为提取溶剂,本实验所选用的溶剂为95%工业酒精｡在这三种提取方法中,索氏提取与回流法都需要加热,实验结果也相差不大,但回流法的实验条件更易于控制,冷浸法不需要加热,但是花费时间长｡

3.2关于比色法测含量

可以与齐墩果酸发生显色反应的试剂有十余种,资料表明用这些试剂显色,都可进行齐墩果酸比色测定｡但经本实验发现,用香草醛-浓硫酸试剂显色,虽然吸光值较大,但是除试剂空白颜色较深外,更主要的是稳定性差,甚至同时做的平行试样,时间稍有不同吸光值就有变化｡因此,本实验选用香草醛-高氯酸为显色剂｡用此方法显色时应注意以下几个问题:①水分对测定有干扰,因此容器必须充分干燥;②提取的样品在挥去溶剂时不能过热,否则齐墩果酸的结构会被破坏,这样会影响测定结果;③5%香草醛-冰醋酸溶液必须临用前新鲜配制,否则显色灵敏度会下降,这可能与香草醛易于被空气中的氧氧化有关;④香草醛和冰醋酸都容易挥发,因此加样时动作要迅速｡

3.3关于高效液相色谱法鉴定齐墩果酸

在色谱条件的建立过程中,开始使选择了80%的甲醇作为流动相,但是实验图谱显示并没有将齐墩果酸分离出来,之后在甲醇中添加了1%的冰醋酸,取得了较好的分离效果｡在进一步实验的基础上,最终确定了甲醇∶水∶冰醋酸=90∶10∶0.1为流动相,保留时间在7min左右｡需要注意的是,流动相配制好后应混合均匀,否则会对保留时间有所影响｡经过对齐墩果酸标准样品的紫外扫描,确定了215nm为检测波长｡

3.4关于发展前景

齐墩果酸结构复杂,人工合成步骤繁多,目前仍依赖从植物中提取得到,虽然借助越来越先进的技术和越来越精密的仪器,今后人工合成的比例会越来越大,但由于从植物中提取得到的齐墩果酸为天然药物,对人体无任何毒副作用,加之齐墩果酸在植物中分布较广,药源比较丰富,在天然药物开发利用已成为世界潮流的今天,齐墩果酸提取的前景仍很广阔｡

4结论

(1)通过不同提取方法的比较,选定回流提取为本研究的提取方法｡

(2)木瓜中齐墩果酸的回流提取最佳工艺条件为温度70℃,提取时间9h,料液比1∶25｡

(3)分离纯化后进行HPLC鉴定,建立的色谱条件为ODSC18色谱柱,柱温25℃,流速1ml/min,紫外检测波长215nm,流动相为甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1｡测得干木瓜中齐墩果酸的含量为1.28mg/g,该方法操作简便,准确度高｡

参考文献

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[4]李东,何伶.高效液相色谱-蒸发光散射检测法同时测定木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量[J].中国医药院学杂志,2005,25(3):259-261.