多能干细胞
多能干细胞范文第1篇
关键词 诱导多能干细胞 重编程 诱导效率 载体 再生医学
中图分类号：Q813 文献标识码：A DOI：10.16400/ki.kjdkz.2016.09.078
Summary of Research Progress on Induced Pluripotent Stem Cells
LI Xueli
（Patent Examination Cooperation Hubei Center of the Patent Office， SIPO， Wuhan， Hubei 430070）
Abstract Induced pluripotent stem cells due to its great research value and application potential quickly become in recent years the world the focus of attention in the field of cell， the government， research institutes in many countries to increase investment， and have made tremendous progress. This article will make a brief summary on the selection of somatic cells in iPSC technology， the selection of the induced factors of reprogramming， the vector， the induction efficiency， the application of clinical study and the problems in the research.
Key words induced pluripotent stem cells； reprogramming； induced efficiency； carrier； regenerative medicine
0 引言
诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell， iPSC），是将几种因子的基因引入到成熟体细胞中，并重编程为与胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）具有相似特征的一种干细胞。①iPSC于2006年由日本京都大学山中伸弥（Yamanaka S）研究团队首次获得。以此为基础，Yamanaka和Thomason（美国威斯康星大学麦迪逊分校）研究团队于2007年成功获得人类iPSC。正是iPSC与ESC在形态、基因表达及多能细胞特异基因的表观遗传学性状上都表现出了极高的相似性，因此研究成果一经报道便迅速引起了干细胞乃至生物医学领域的广泛关注。一向对人类胚胎干细胞领域研究持有争议态度的美国政府，在该研究成果后的几年中，也逐渐放开了对干细胞领域研究的相关政策，认为这才是干细胞研究的正道。
iPSC技术被认为是生命科学和再生医学研究领域的一场革命，在其诞生的十年时间里就被广泛研究并获得了快速的发展。世界范围内许多实验室开始探索其相关机制及技术的改良方法，研究主要集中在体细胞和重编程因子的选择、重编程因子介导载体体系的建立、诱导转化率的提升以及疾病特异性的iPSC模型的建立等方面。
1 体细胞的选择
在体细胞选择方面，研究发现，除了成纤维细胞，小鼠的肝细胞、胃细胞、B淋巴细胞、神经干细胞，以及人类的骨髓间充质干细胞、角化细胞、外周血细胞、皮肤成纤维细胞、胚胎成纤维细胞、脂肪干细胞等都可产生iPSC。②而有丝分裂后的神经元和终末分化的淋巴细胞也可诱导形成iPSC。③由此可见，似乎所有的体细胞都具备经过重编程而被诱导成为iPSC的潜能，但是不同细胞类型对产生iPSC的效率、诱导因子作用效果和获得的iPSC的安全性具有很大的差别。④例如，人类角质细胞比成纤维细胞重编程的效率高；小鼠胃细胞与肝细胞在激活ESC特异性Fbx15基因时，比成纤维细胞效率高，且整合的病毒少；不同类型的体细胞（小鼠尾部皮肤细胞、胃细胞以及胚胎皮肤细胞）诱导产生的iPSC会导致小鼠体内肿瘤出现概率的不同。
2 重编程因子的选择
尽管Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4是最先发现的可以将成纤维细胞重编程转化为iPSC的4种重编程因子，但是随着研究的深入，发现在一定情况下，一些因子的调整或替代，同样也能获得良好的诱导效果，⑤如Oct4、Sox2、Nanog、Lin28也可以将人类成纤维细胞重编程转化为iPSC；Oct4和Sox2两种因子就能将人脐血干细胞重编转化为iPSC；人成纤维细胞可以内源性表达c-Myc和Klf4，在重编程转化过程中，没有外源性c-Myc的参与也能成功获得iPSC；对于内源性高表达Sox2和c-Myc的神经干细胞，仅用Oct4即可重编转化为iPSC。这些研究结果说明成熟体细胞的重编程存在多个信号途径。
3 重编程因子的介导载体
慢病毒和逆转录病毒是iPSC技术研究初始阶段用于介导重编程因子的两种主要载体。但随着研究的逐渐深入，发现慢病毒载体和逆转录病毒载体可能会造成外援致瘤因子整合进入细胞基因组内，引起插入突变。病毒基因的激活已经导致由iPSC分化产生的小鼠体内产生了肿瘤，这一结果无疑给iPSC在临床转化及应用方面引入了不小的风险，甚至会导致不良后果。
正是因为发现了存在载体在使用过程中、或是诱导基因本身会引发致瘤的问题，很多研究小组致力于寻找方法能够产生非整合的iPSC来减少致瘤风险。这些方法包括腺病毒、仙台病毒、质粒、合成RNA、蛋白质、piggyBac转座子和小分子诱导重编程等，并且这些方法已经在实验室水平得到实现。⑤⑥虽然现阶段有关安全介导载体体系建立的研究还不太成熟，但相信随着研究的逐步深入，科学家们终将会寻找到最安全、也最适合用于人类iPSC的诱导方法，从而将风险降到最低。
4 iPSC的诱导转化率
虽然iPSC建系可重复，但效率很低，并且在提高iPSC安全性的同时会伴随着重编程效率的降低。因此，提高iPSC重编程效率也一直是该领域研究的重点。虽然iPSC形成的分子机制不是十分清楚，但是研究发现很多因素，如细胞类型、重编程因子、载体，甚至培养条件和微环境都与iPSC的诱导转化率相关。④⑤如脂肪干细胞以Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4因子重新编程的效率达到0.2%，且是相同条件下皮肤成纤维细胞的20倍；利用逆转录病毒作为载体诱导人幼年角质形成细胞重编程的效率要达到成纤维细胞的100倍；缺氧微环境培养iPSC，其生成效率可提高至原来的2.5-4.2倍。
5 iPSC的应用
iPSC对医学领域最直接的贡献在于为疾病的研究提供了体外模型，如，Rashid等⑦成功利用肝病患者的皮肤细胞培育出与病人肝脏细胞高度相似细胞；来自iPSC的心肌细胞和肝细胞，可以替代现有的方法用于毒理学试验，这些是其它细胞所无法比拟的。一方面，利用从病患身上产生的iPSC，可以简化建立疾病模型的过程，提高模型仿真性，更有利于了解该种疾病的发病机理；另一方面，iPSC可以为新药的开发提供模型，用于测试候选药物的疗效、毒性，以及筛选新的药物治疗方法。⑧
iPSC技术为未来使用干细胞研究及治疗各种疾病开辟了新的研究途径，如何将iPSC在体外定向分化为能模拟体内情况的功能性细胞，以及如何获得足够量的靶细胞用于下游的应用将成为今后研究的重点。
6 iPSC研究存在的问题
虽然iPSC技术发展迅速，有着诱人的应用前景，但对该领域的研究总体还处于最初的探索阶段，并且在该技术发展的过程中还存在诸多的问题，这些都使得iPSC技术应用在临床方面还具有很长的距离。
（1）iPSC与ESC有差异吗？iPSC存在的最重要的问题之一就是它与ESC是否真正相似。虽然有部分结果显示它们存在差异，但大部分实验还是表明iPSC与ESC在各方面都具有惊人的相似性。显示两者具有差异性的研究结果可能是由于不同实验室所采用的相关实验条件的不同所造成的。同时，山中伸弥认为“ESC不应当成为判断iPSC特性的金标准，研究者应更加关注iPSC自身的性质”。
（2）iPSC产生的效率问题。iPSC产生的效率较低。这与基因导入的方式、整合位点、表观遗传学、转录因子表达的数量和模式等多种因素有关。如：Oct-4在胃或肠内的表达阻止了原始细胞的分化。同时，由于来源于多能干细胞的组织在移植后的存活率很低，因此iPSC在临床应用上也将会面临移植后要求组织存活较长时间的问题。
（3）安全问题。在iPSC技术中，用病毒作为载体可能会导致外援基因整合进入细胞基因组，致使一些癌基因的激活或某些重要基因的表达受阻；并且重编程因子c-Myc和Klf4属于致瘤因子，因此这些因素都将有可能引起基因的突变，从而产生具有高致瘤性的iPSC。这些问题将成为iPSC科学研究和临床应用的最大障碍。
（4）机制问题。几个转录因子如何完成细胞由分化状态逆转为多能性状态？如何从根本上解决致瘤性的问题？为何iPSC诱导效率低下，分化能力存在差异？这些问题都需要通过对体细胞重编程的分子机制、分化机制以及调控机制等进行深入的研究来解答。
注释
① Yamanaka S.诱导多能干细胞（iPSCs）：过去、现在和未来.朱丽华，译.中国细胞生物学学报，2012.34（10）：1055-1062.
②⑧Kiskinis E，Eggan K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation，2010.120（1）：51-59.
③ Kim J， Lengner CJ， Kirak O， et al. Reprogramming of postnatal neurons into induced pluripotent stem cells by defined factors. Stem Cells，2011.29（6）：992-1000.
④ 李鑫，王加强，周琪.体细胞重编程研究进展.中国科学：生命科学，2016.46（1）：4-15.
⑤ Gonzalez F， Boue S， Belmonte， JCI. Methods for making induced pluripotent stem cells： reprogramming a la carte. Nature Reviews Genetics，2011.12（4）：231-242.
多能干细胞范文第2篇
【摘要】
为了研究低血清条件下从脐血中分离多能非造血成体干细胞的相关影响因素，探索优化培养条件，通过不同培养液、接种密度、首次换液时间对脐血多能非造血成体干细胞生长的影响的比较，并以选定的条件对其培养扩增，进行免疫表型及诱导分化能力检测。结果表明：在低血清条件下，DMEM/F12培养液更适合于脐血多能非造血成体干细胞生长； 1×106／cm2是原代培养的适宜接种密度，原代第72小时首次换液为最佳换液时问。利用所选条件培养的细胞可在体外持续扩增，并具有良好的分化潜能。结论：建立了人脐血多能非造血成体干细胞的体外优化培养条件，为其在组织工程方面的应用作出了新的探索。
【关键词】 干细胞； 多能非造血成体干细胞； 脐血； 分离效率
Related Factors Affecting the Isolation of Multipotent Non-hematopoietic Adult Stem Cells from Umbilical Cord Blood
Abstract
To investigate the related factors affecting the isolation of multipotent non-hematopoietic adult stem cells (MNASCs) from human umbilical cord blood in low serum (2%) condition，the isolation conditions were optimized and the yield of MNASCs was improved. MNASCs from human umbilical cord blood samples were isolated，and the effects of medium component，medium exchange time and initial plating density for isolation of MNASCs were studied. Then，the MNASCs were isolated and cultured in optimal condition，the surface antigen expression and differentiation potential of MNASCs were detected. The result showed that the medium of DMEM/F12 was better than IMDM and DMEM-LG for MNASCs culture in low serum condition. The optimal yield of MNASCs was obtained when mononuclear cells were cultured at a initial plating density of 1×106 cells／cm2 and the medium was exchanged to remove the nonadherent cells after 72 hours of inoculation. MNASCs isolated and cultured under the above-mentioned conditions maintained a homogenous morphology，high potential ability of expansion and differentiation. It is concluded that culture conditions with low serum defined in this study is optimal for the successful isolation and expansion of umbilical cord blood MNASCs with high numbers for subsequent cellular therapeutic approaches.
Key words stem cell; multipotent non-hematopoietic adult stem cell; umbilical cord blood; isolation efficiency
近年来一些研究发现，脐血中存在具有多向分化潜能的非造血成体干细胞(multipotent non-hematopoietic adult stem cells，MNASCs)。这类细胞可在体外培养扩增，并且能够分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种组织细胞 ［1，2］。由于脐血干细胞具有资源丰富、增殖和自我更新能力强、免疫原性弱等优势，对其进行开发和应用将对干细胞组织工程及其应用具有深远意义。
目前从脐血中分离多能非造血成体干细胞多数仍然沿用Friedenstein等建立的贴壁传代分离培养的方法，即利用不同细胞成分在塑料介质上黏附特性的差异，借助换液去除不贴壁的杂质细胞，传代纯化。本研究对利用这一方法在低血清条件下分离脐血多能非造血成体干细胞的相关影响因素进行了探讨，结果表明所用培养基种类、起始接种密度、初次换液时间等都是影响分离的重要因素。
材料和方法
脐血多能非造血成体干细胞的分离和培养
将脐血以PBS缓冲液2倍稀释后，用淋巴细胞分离液（相对密度为1.077），400×g，离心20分钟，分离单个核细胞（MNC），洗涤后重悬于DMEM/F12培养液（Gibco BRL公司产品）中，计数细胞，用含2%胎牛血清（FBS，天津灏洋生物公司产品）、40% MCDB-201（Gibco BRL公司产品）、10 ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，PeproTech产品）、1×胰岛素－转铁蛋白－亚硒酸钠（ITS，Gibco BRL公司产品）的DMEM/F12培养液稀释，以1×106/cm2的细胞密度接种于6孔板中。置于饱和湿度、5％ CO2的37℃培养箱中培养，72小时后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每周换液2次，第14天计数集落数，超过50个细胞计为集落。当细胞达到70％－80％融合时，以含0.25％胰酶－0.1％EDTA的消化液消化，计为P0代细胞，传代培养。在检验培养基的影响时，脐血MNC分别以IMDM、低糖DMEM（DMEM－LG）、DMEM /F12培养基进行培养；检验接种密度的影响时，脐血MNC分别以1×105/cm2、5×105/cm2、1×106/cm2、2×106/cm2密度接种；检验初次换液时间的影响时，分别于接种后24、72、120小时换液；其它条件均不变。
P2代细胞集落形成及检测
在各个培养条件下获得的P2代细胞以10/cm2密度接种于培养皿中，培养14天后，以95％乙醇固定，加入1％结晶紫染色，显微镜下计数集落，超过50个细胞计为集落。结果以每100个细胞形成的集落数（%）表示。
细胞免疫表型分析
收集培养第3代细胞，以PBS洗涤2次，分成每管含2.5×105细胞，分别加入小鼠抗人PE或FITC标记的单克隆抗体CD3、CD11a、CD29、CD31、CD34、CD73、CD45、CD44、CD105、CD144、CD49d、CD49e、CD62L和HLA-DR （均为Becton Dickinson公司产品）等10 μl，阴性对照管加FITC标记及PE标记的兔抗鼠IgG1各10 μl，4℃避光孵育30分钟，以PBS洗涤后用10 g/L多聚甲醛固定，用流式细胞仪检测分析。
成脂、成骨及神经诱导分化及分化后鉴定
消化体外扩增的第3代细胞，以5×103/cm2的密度接种于预先放置无菌消毒盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2 ml上述分离培养液。在细胞达到60％-70％融合时，更换诱导分化培养基。
成骨诱导分化
诱导分化培养基为含有10-7mol/L的地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油，0.05 mmol/L 2-磷酸抗坏血酸（均为Sigma公司产品）和10％ FBS的DMEM /F12培养液，每周换液2次，培养14天。取出玻片，用PBS洗涤1次，70％酒精固定10分钟，行茜素红及Von Kossa染色，镜检，照相。
成脂诱导分化
诱导分化的培养基为含有10-6mol/L的地塞米松，5 μg/ml胰岛素，0.5 mmol/L 异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)，60 μmol/L消炎痛（均为Sigma公司产品）和10％ FBS的DMEM /F12培养液，每周换液2次，培养21天。取出玻片，用PBS洗涤1次，70％酒精固定10分钟，以油红O染色，镜检、照相。
神经诱导分化
诱导分化培养基为含20 ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、20 ng/ml人表皮生长因子（EGF）（均为PeproTech产品）、0.5 μmol/L全反式维甲酸（Sigma公司产品）和10％ FBS的DMEM /F12培养液，每周换液2次，培养14天。参照HistostainTM－plus试剂盒(SP-9002，北京中山生物技术公司产品) 操作方法进行抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色。实验对照用未诱导细胞爬片直接进行免疫组织化学染色。收获诱导14天细胞，TRIZOL (Invitrogen公司产品)提取总RNA，RT-PCR检测神经巢蛋白（nestin）及中间神经丝（NF-M）表达。nestin上游引物5’-AGGATGTGGAGGTAGTGAGA-3’，下游引物5’-TGGAGATCTCAGTGGCTCTT-3’，NF-M上游引物5’-GAGCGCAAAGACTACCTGAAGA-3’，下游引物5’-CGACTCTAGCTCGATGCTCTTG-3’。
统计学处理
多组间的比较采用Kruskal-Wallis非参数估计，两样本间的比较采用Mann-Whitney 秩和检验。
结果
培养基种类对分离效果的影响
在低血清条件下，3种培养液中均可有贴壁细胞出现，在形态上这些贴壁细胞没有明显差异。在随后的培养过程中，DMEM/F12培养液中的细胞生长迅速，在第14天时每106 MNC形成的集落中位数为1.35个（1.1-1.5个），而在IMDM、DMEM-LG培养液中的细胞多数死亡，仅少数形成集落，每106 MNC形成的集落中位数分别为0.25个（0.1-0.4个）和0.05个（0-0.2个），明显低于DMEM/F12培养液（P
初次换液时间对分离效果的影响
比较不同首次换液时间对原代细胞集落形成影响的结果表明，在首次换液时间为72小时的条件下，每106MNC形成的集落中位数为1.4个（1.1-1.5个），而在24小时、120小时换液的条件下分别为0.3个（0.2-0.7个）、0.7个（0.5-0.9个），前者明显高于后两者（P
转贴于
初次接种密度对分离效果的影响
在以0.1×106/cm2的密度进行接种时，脐血的MNC不能形成集落，黏附细胞不能传代培养。比较其余的接种密度表明，在相同培养时间内，接种密度越高所获得的原代集落数、P2代细胞数目越高（P
脐血质量对分离效果的影响
分析不同时间以及MNC数的11份脐血分离培养成功率的结果见表2。虽因标本数少，未作进一步统计学分析，但从表中可以看出，脐血采集至分离的时间和脐血中MNC的数目可能对分离结果存在影响，采集至分离时间≤4小时且MNC细胞数≥1.2×108的脐血分离成功率较高。
脐血来源的多能非造血成体干细胞功能检测
根据上述研究，采用优选的分离培养条件（含2% FBS、40% MCDB-201、10 ng/ml bFGF、1×ITS的DMEM /F12培养液，以1×106/cm2的细胞密度接种、72小时后换液），能够从脐血中分离出形态均一，且稳定传代的多能非造血成体干细胞（图1）。经体外诱导后具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能，前者以油红O染色可见胞浆充满油滴空泡;后者用茜素红染色，可见胞浆中有大量的钙沉积（图2），Von Kossa和ARS染色显示有黑色的钙化基质沉淀（图3、4）。在神经诱导分化后，分化细胞表达神经元细胞标志NSE 、NF-M 、nestin（图5）。细胞免疫表型检测表明，获得的细胞表达CD29、CD44、CD105，CD49e，CD73，不表达造血细胞的表型CD34、CD45，CD3，HLAII类分子HLA-DR 以及CD11a，CD31，CD62L弱表达vWF、CD44、CD49d等（图6）。Table 2. Characteristics of umbilical cord blood units（略）
讨 论
种子细胞是组织工程十分重要的原料，成人体内存在的多能非造血成体干细胞作为组织工程较为理想的种子细胞已经成为当前的研究热点。目前的研究已经证实，脐血中间除造血细胞外尚存在有这类多能非造血成体干细胞。但是此类细胞较低的含量促使我们必须寻找一种高效分离培养的方法以获得临床应用所需的细胞数量。因此，我们从几个方面对其培养方法进行研究，以探寻一种优化的培养方法，为脐血多能非造血成体干细胞在组织工程方面的应用作一定的探索。
高血清的条件下细胞容易发生分化，同时，血清成分复杂，虽含许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分，不同批号之间存在的质量差异，可能使得实验和生产难以标准化，不利于今后的临床应用。既往的研究已经证实，低血清培养液可有效地避免脐血间充质干/ 祖细胞丧失其增殖分化潜力［3］，因此在本实验中我们对在低血清条件下从脐血中分离多能非造血成体干细胞的相关影响因素进行了研究。
IMDM、DMEM－LG、DMEM /F12培养液是目前成体干细胞培养中应用较为普遍的培养液，在通常的培养条件下都取得了较好的培养结果，且DMEM/F12培养液更是作为无血清培养液的基础培养液得到广泛应用。我们的实验结果表明，在低血清的条件下，仅DMEM/F12培养液有利于脐血多能非造血成体干细胞的生长，IMDM、DMEM－LG培养液都难以满足这类细胞的生长要求。虽然有作者认为，含10% FBS的DMEM－LG低糖和偏酸性的环境能够减少造血细胞的污染，有利于从脐血中分离出具有多向分化能力的非造血前体细胞［1］，但是在降低血清浓度并进一步加入细胞生长添加剂的情况下，过低的糖浓度可能不利于细胞的生长。Sotiropoulou等［4］在研究影响人骨髓间充质干细胞(MSC)分离培养的因素时发现，骨髓MSC在IMDM培养液中生长不超过P1代，与其结果相似，我们也发现IMDM培养液在低血清的条件下难以支持脐血多能非造血成体干细胞的长期传代生长。
由于目前从脐血中分离多能非造血成体干细胞多数仍然沿用脐血的MNC贴壁传代分离培养的方法，因此在原代接种时，脐血中的多能非造血成体干细胞与造血干祖细胞之间可能存在复杂的相互作用。造血细胞可能通过直接接触和分泌细胞因子影响其它细胞的生长。我们的研究表明，分离过程中初次换液时间过长，与造血细胞长时间的接触会抑制已经贴附的多能非造血成体干细胞进入增殖状态，影响所获细胞的数目及集落形成能力。这可能是由于营养消耗、细胞死亡等原因造成环境恶化所致，也可能与造血细胞分泌的细胞因子促进细胞分化有关。而初次换液时间过短，细胞未能充分黏附，也影响最终获得的细胞数目。
接种密度是原代培养中另一个关键问题，同样影响细胞之间复杂的相互作用。当原代培养的细胞初次接触体外环境时，细胞之间的相互影响是很重要的，细胞可能产生一些促生长活性物质来互相促进存活和生长。此外，细胞密度过大，贴壁细胞无足够的空间伸展；细胞密度过低时，细胞形成克隆和达到传代所需密度的时间又很长，造成原代细胞“老化”，使其在传代后的扩增能力和分化潜能都明显下降。对骨髓来源的MSC的研究表明，在10%-20%血清浓度下，低密度（1×103/cm2）或极低密度（1或3个细胞/cm2）接种有利于MSC细胞的分离扩增［4，5］。但在实验中我们发现，在降低血清浓度的条件下，过低的初始接种密度不利于脐血多能非造血成体干细胞的分离，这与Tamama等［6］最近的研究相似，他们发现，在高密度培养时骨髓MSC对低血清环境的耐受性较低密度培养时更强。这可能与低密度培养时P21和P27细胞周期依赖激酶抑制剂表达减低，从而导致细胞凋亡［7］或是细胞间分泌的细胞因子不足，影响细胞的生长有关，而过高的接种密度则可能使造血细胞的影响更为明显，使细胞的获得率和CFU-F数降低。在兼顾所获细胞的数量与质量要求的条件下，采用初始接种密度1×106/cm2较为合适。
Bieback等［8］对从脐血中分离MSC样细胞的研究中发现，脐血量、采集至分离的时间及MNC的数目都是影响分离效率的因素，在采用理想的脐血（≤15小时、脐血量≥33 ml、MNC含量≥1×108）条件下进行分离时，分离成功率明显增加。我们对不同时间及不同MNC数的11份脐血分离培养的成功率调查中也见有类似的趋势。采集至分离的时间及脐血中的MNC数目都可能是影响分离效率的重要因素。在采集至分离时间≤4小时且MNC含量≥1.2×108的脐血标本的分离成功率较高，这一指标有可能作为今后优选脐血标本的标准。但仍需要进行扩大样本量的研究来证实。
利用我们的优化分离条件，我们检测了分离得到多能非造血成体干细胞（MNASC）的免疫学表型和分化潜能。结果证实，所分离的MNASC具有类似骨髓MSC的表型，并且具有成脂肪、成骨和神经分化潜能。细胞在此优化条件下能够稳定传代，并能满足将来组织工程的应用需要。
参考文献
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多能干细胞范文第3篇
现在医学上正流行着一种全新的疗法,叫做细胞疗法,不过在这种疗法之中,所用的细胞并非一般的细胞,而是干细胞。干细胞是生命之源;用干细胞治疗的,就叫干细胞移植疗法或叫干细胞疗法。干细胞及其移植是当今世界医学研究的热点之一,是人类疾病治疗的新希望,作者翻阅了一些文献,现综述于下。
1 名称的演变
这里需要从头说起。这种细胞当初被发现时因其形态而称其为卵圆细胞;后来知道这种细胞是一种还没有开始发育成具有特殊功能的细胞,在做实验时将其置于培养液中,可以观察到它能不断地分裂,并最终发育成各种功能特殊的细胞,所以就授名为原始细胞(或祖细胞);因能繁衍出许多职能不同的“子孙”来,因此干细胞也叫源泉细胞;随着研究的不断深入,进一步发现这种细胞在体内会定向发展为具有不同功能的细胞,并进而形成各种类型的器官或组织,就像树干那样,能够派生出形状各异的枝桠;这些枝桠就像人体的各种器官和组织一样。这就把繁多的名称修订为正式而通用的名称,叫干细胞(stem cell)。干细胞是一个总称,因其作用广泛,故也称为全能细胞或万能细胞;但在正式场合还得用其正名干细胞或××干细胞。这诸多名称的曲折来源说明其不同的研究阶段,同时也说明了另一个问题,即对干细胞的研究在逐步地深入。
2 学术性分类
干细胞还可以将其分为三种,即胚胎干细胞(受精卵细胞)、成体(作体)干细胞和单能(专能)干细胞。
2.1 胚胎干细胞 人类的和卵子结合后就成为受精卵,是最初的全能受精卵细胞,也就是全能干细胞,是最原始而又高度未分化的细胞,进一步发育便成胚胎干细胞;胚胎干细胞可以再分化成任何组织的细胞,如血液、肌肉、神经、肝脏、肾脏和胃肠等的细胞,从而形成任何种类的器官或组织,最终分化、发育成一个完整的人体,还可以直接克隆人,所以胚胎肝细胞就被学者们誉称为全能细胞或万能细胞;真正有“全能”者,应当是只指胚胎干细胞。理论认为,这种细胞能分化成人体200多种组织中的任何一种组织;在体外特定的培养条件下能够无休止地分裂、增殖和传代,且在其全段培养时间内,其“全能”特性不变。因为胚胎干细胞有全能性,物质来源非常丰富,且可利用性又极强,所以是全球学者研究的最热的热点。1998年,人体胚胎干细胞体外培育成功。
2.2 成体干细胞 是一种或多种组织、器官的起源细胞,是来之于胚胎干细胞的分化,它包括了骨髓干细胞(造血干细胞、间质干细胞)、外周血干细胞及脐血干细胞三种;前两种是干细胞移植的主要来源;从这些标本分离到的成体干细胞株能在体外培养中生存、繁殖,并能横向分化,像工厂一样无限制地产生出和自已完全相同的物品来;这些物品就是“子代细胞”,在人体内已经分化成熟的成体干细胞,可以进一步发展成为实体组织,所以叫“成体”;成体干细胞有别于其他一般成熟的细胞,一般成熟的细胞只能固定分裂为相同功能的细胞,不能进一步横向分化来组成各种组织或器官,如肝细胞和皮肤细胞等,只能分别垂直地分化和生成新的肝细胞和皮肤细胞,而成体干细胞则可以在体内再横向分化为组成组织或器官时所需要的具有独特功能的细胞,如骨髓干细胞可转化成神经细胞和肝细胞,间质干细胞能转化为肌肉、神经、软骨和骨的细胞,脂肪干细胞能转化成神经细胞等,使这些相应的患病器官和组织得以修复或再生;成体干细胞因而被称为多能(亚全能)干细胞,但其分化、发育能力受到一定的限制,不能再进一步成形完整的个体,最多只能发育成20多种组织或器官,这和胚胎干细胞有别;人体出生后几乎所有的组织和器官中都本能地残存着一些成体干细胞,不过它们处于静止状态,既不增殖又不分化,不参与胚胎的继续发育,但却保持着原有干细胞的基本特性,待机体处于病变状态时,能够随时修复,或取代受损或病变的组织;但残存的成体干细胞的数量极为有限,虽然骨髓含有较为丰富的成体干细胞,可直接用于治疗,但它很少释入外周的血液中;在作移植治疗时碍于血中来源稀少而难以凑足治疗所需的数量,以抗击所患的诸多疾病,因此临床应用就受到一定的限制,除非给予人体粒细胞集落刺激因子的药物,以动员骨髓中的成体干细胞大量泌入外周血液里,以达足够的治疗量。
2.3 单能干细胞 这一种干细胞是由多能干细胞转化来的,只能分化成某一类型的细胞,像神经干细胞只能转化成各类的神经细胞,造血干细胞只能化成各种不同的血细胞,皮肤干细胞和肝干细胞等,只能分别形成为皮肤细胞和肝细胞等,不能再横向分化成各种组织、器官了,所以被称为“单能”。
3 自体干细胞和异体干细胞
这两个名称都不是细胞的专有名称,但却属于成体干细胞的范畴。顾名思义,前者是指自己体内生成的成体干细胞,用其来治疗自己所害的疾病,属于自救疗法;后者是指利用别人体内分泌的成体干细胞来治疗自己所患的疾病,属于他救疗法。这两种疗法都可产生同样的效果,但以自体干细胞移植为优,因其移植后无宿主组织排异现象,甚为安全,且移植过程简单,当今多采用此一疗法;异体干细胞移植则相反,可以引起宿主组织排异,除移植简单相同外,尚存在着隐患。
4 干细胞的移植
干细胞移植可分为三种,即自体干细胞移植、异体干细胞移植和胚胎干细胞移植。自体干细胞移植疗法是指把患者体内的干细胞提出,经体外培养使其大量增殖,并诱导其分化成特定的组织细胞,随后将这些细胞注入患者体内,达到其修复或重建组织、器官的目的;胚胎干细胞移植得先提出患者的体细胞的细胞核,然后将其与除去了细胞核的胚胎卵细胞相结合,形成一个带有患者遗传特征的胚胎干细胞,接着再做增殖、分化,才能移植于人体。治疗难度它比自体干细胞移植治疗难度要大得多;它和异体干细胞移植一样,会彼此排斥,故得使用免疫抑制手段。
干细胞的用途极其广泛,几乎涉及到所有的医学领域。目前已经能够在体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞,并以此为“种子”,培育出一些人体的组织、器官,即再造人体正常而年轻的组织或器官,来替代病变或衰老的组织或器官,使其重获或改善原有的功能,促使人体恢复健康。
50多年前,我国就开始干细胞的研究了,以后就逐渐地引入于临床治疗;开始是利用干细胞中的一分子即骨髓干细胞(造血干细胞)移植,来治疗各类白血病;上世纪80年代,外周血干细胞移植术获得了推广,不过大多移植自体外周血干细胞,仍然主要用于治疗白血病;近20多年来,移植已经超越血液病范围,并迅速扩展,几乎波及整个人体的组织与器官的疾病;各方研究者都称自己取得了瞩目的、突破性的、甚至是世界领先的成绩。
干细胞研究的水平国内、外相差无几,但就研究对象而言,国内的实验研究较少,而是单刀直入,直接地广用于临床治疗,以致有人认为对世界来说此举是种原创性的贡献。国外则偏重于动物实验,在动物身上可取任何实验时段,充分观察实验过程,以判良莠,然后再取舍地用于临床。虽然动物实验与人体实地治疗不尽相同,但是可给人类治疗提供借鉴性依据。国外干细胞移植至今多处于动物实验阶段兴许就是这个原因。他们所用的动物种类也较为广泛,从低级到高等都有,例如有鼠类、兔、小猪、犬、牛和猴等。
从国内的干细胞移植治疗的情况看,作者依据手头大多为国内资料的国内、外报道,按系统简单地罗列于下,供读者参考:血液系为白血病、淋巴瘤、再障和地中海贫血等;心血管系为急性心肌梗塞、急性心肌炎、陈旧性心肌梗塞和慢性心功能不全等;神经系为脑瘫、老年痴呆症、中风、帕金森病、脊髓损伤、脑梗塞、多发性硬化症、多系统萎缩症、脱髓鞘症、运动神经元病、肌张力障碍、特发性震颤和神经母细胞瘤等;消化系为各种肝病、炎症性肠病和胰腺病等;免疫系为风湿病和风湿性关节炎等;代谢系为糖尿病及其并发的下肢缺血性疾病等;骨系为骨骺疏松症等;眼系为角膜病和复发性胬肉等;外科系为烧伤等;实体癌肿为卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌、转移性恶性黑色素癌、多发性骨髓癌及恶性淋巴癌等;其他方面为抗感染和减轻化疗的副作用等。但从报道来看,只有血液病的干细胞移植治疗有较丰富的经验;据一家有1000多个病例、颇有经验积累的报道,其成功率为90%,长期无病的存活率为70%以上;除此之外,其他各系疾病的干细胞移植治疗,在数量、质量、随访和副反应方面,都有进一步提高和观察的必要。干细胞
移植和器官移植是医学治疗学上的两个终极性疗法,前者最后势必以其优势而取代后者。我国的干细胞移植治疗面是相当广泛的。
5 部分异议
虽然从理论及部分实践来看,干细胞移植疗法的前景是十分光明,是值得向往的,但是从现在的形势来看,还不是那样。我国一些知名专家认为,当今的干细胞移植只是处于从基础实验到临床治疗的一个过渡阶段,其有效性及安全性都还知之甚少,且评价不一,还缺乏充分的科学验证;认为继续探索之路还很长,估计还要再过10~20年之后,移植的有效性和安全性如何才能见分晓。所以干细胞疗法在当前还远不是广泛推广于临床的时候,更不能“遍地开花”;甚至还有专家提出了劝告说,在干细胞移植研究的评议时要实事求是,避免夸大。据悉国家也只批准少数几家试点医院和几个病种可行干细胞治疗,并不提倡临床推广;目前也无这一疗法的规范性技术标准可供参考;卫生部正在拟订《人体干细胞技术临床应用管理办法》。专家们认为干细胞临床移植治疗应以慎行为好。有些学者认为,胚胎干细胞和成体干细胞的定向发育的机制尚不清楚,这样会有碍于治疗的合理性。也有一些学者认为,胚胎干细胞研究必需从胚胎干细胞中提取干细胞,从而造成胚胎细胞的凋亡,已涉及到伦理问题,因而不主张、甚至反对胚胎干细胞的移植。也有人认为癌干细胞是否存在,还应积极地探索。
多能干细胞范文第4篇
干细胞能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞。既具有生理性的更新能力，又具有对损伤疾病导致的修复功能。干细胞归巢于新的组织后，在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，实现组织的更新和修复。丹参具有活血化瘀、理气止痛的功效。近年许多实验证实丹参在诱导干细胞增殖和分化上显示出巨大的潜力，选择性采用神经干细胞标志物巢蛋白(Nestin)、神经元标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、βⅢ微管蛋白(βⅢTubul{n)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行鉴定，结果显示阳性，表明中医药在干细胞研究的道路上迈出了新的一步。
1 干细胞的概念及生物学特性
干细胞(stem cell，SC)是一类具有自我更新和多向分化增殖潜能的原始细胞，能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞。既具有生理性的更新能力，又具有对损伤疾病导致的修复功能。目前公认的干细胞应具备的几点主要细胞生物学特点有：①具有自我更新能力与维持能力，也就是说它可以分裂，分裂后的子细胞与母细胞一样保持其原有的各种细胞生物学特性，而且还可以不断地分裂下去。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，不同于那些有限自我更新能力的祖细胞。这对于维持机体组织器官的稳定性有很重要的意义；②具有多向分化的能力(多能性或全能性)，可以分化发育成各种胚层组织的细胞，或可以分化成为本系统各谱系的细胞(特定组织干细胞，如造血干细胞)；③既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应与修复能力，如骨髓间充质干细胞等；④干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境(nitches)，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将胚胎细胞种植人小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。
2 干细胞的分类
干细胞存在于早期的胚胎、骨髓、脐血和部分成年人的细胞中。在一定条件下可以分化为多种功能细胞。
2．1 按分化潜能的大小分类可分为3种：一是全能性干细胞，它具有分化成人体内各种细胞的潜能，如胚胎干细胞；另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可以分化出至少12种血细胞，还可以分化出造血系统以外的其他细胞；还有一类为单能干细胞(也称专能、偏能干细胞)，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的肌原细胞或叫卫星细胞。
2．2 根据干细胞生存阶段分类可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两类。胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎内细胞团中的一种二倍体细胞，一般可从植入子宫内膜前的囊胚中分离出来。这种细胞是能在体外培养的一种高度未分化细胞，具有全能性或多向性分化潜能。它们能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞。它们的基本特性是具有发育的全能性，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因而有人称之为“万能”细胞。美国的威斯康星大学的Thomson等和霍普金斯大学的Gearhart实验小组分别报道用不同材料、不同方法成功地分离并建立具有多向分化潜能和永久生殖能力的胚胎干细胞(ES)细胞系和畸胎瘤干细胞(Ec)细胞系。研究模型的解决，为人类的健康和现代生命科学的发展、研究开创了一个新时期。成体干细胞也称为特定组织干细胞，多能干细胞继续向前分化则成为定向祖细胞(committed progenitor)，持续停留在某种组织中，被称为特定组织干细胞。它们在特定的条件下，可以对称地分裂为2个新的子代干细胞或2个功能细胞，也可以不对称地分裂成1个子代干细胞和1个功能干细胞，从而使组织分化与器官保持生长和衰退的动态平衡。它们具有自我更新和产生本系统后续细胞的增殖细胞，如造血干细胞(hernatopoietic stem cell，HSC)、骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cdt，MSC)、神经干细胞(neural stem cdl，NSC)、肌肉干细胞、表皮层干细胞、肝干细胞，最近我国已成功培养心肌干细胞等。传统的观点曾认为成体干细胞的分化潜能较弱，只能分化成与其组织来源一致的某种特定的组织细胞。然而在某些情况下，干细胞的分化并不遵循这一规律。在实验中分离出小鼠的肌肉干细胞，经过体外培养7 d后，将它与小量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化成为各种造血干细胞系。这种现象被称为干细胞的可分化性H]。迄今对成体干细胞研究较多的是造血干细胞和骨髓间充质干细胞；其次神经干细胞的研究也较多，以及成肌干细胞和皮肤干细胞。也许是人们渴望找到一种对于神经系统退行性疾病的有效治疗方法，近年来对于神经干细胞的研究颇多也颇深入，并且已经有实验表明神经干细胞的移植可以治愈帕金森病。事实上可能各种成体组织中均含有分裂能力的干细胞。当组织受到外伤、老化、疾病等损伤时，这些细胞就增殖分化产生新的组织来代替，以保持机体平衡。
3 丹参与千细胞的相关实践基础
干细胞归巢于新的组织后，在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，才能实现组织的更新和修复。关于干细胞分化的调控机制目前还不十分清楚，大多数的观点认为与微环境的调控密切相关。干细胞通过与邻近细胞、细胞基质和细胞因子的相互作用，而影响其分化进程。丹参(Slvia miltiorhiza Bge)在临床广泛应用于心、脑、肝缺血／再灌注损伤的保护、调节免疫应答、抗感染等，其在诱导干细胞增殖和分化上亦显示出巨大的潜力。其成分包括：丹参酮I、IIA、IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮、原儿茶醛、丹参素等。丹参注射液具有活血化瘀、理气止痛的功效，是临床治疗冠心病、心绞痛的常用中药。近年发现丹参注射液有细胞诱导作用，孟凡刚等用丹参诱导成年小鼠骨髓基质干细胞，分别于诱导后5h，24h，72h进行免疫细胞化学染色，结果显示巢蛋白(Nesfin)和βⅢ一微管-蛋白(BⅢTubulin)均呈阳性表达。杨立业等用丹参注射液诱导鼠间充质于细胞分化为神经样细胞。项鹏等用丹参注射液诱导成人骨髓间质干细胞，为进一步确定MSC是否分化为神经元，采用神经元标志物神经元特异性烯醇化酶、NF、神经干细胞标志物巢蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAD)进行鉴定。结果显示，丹参诱导5h后，多数细胞表现为NSE阳性，棕黄色染色，细胞形态多样，出现简单的双极细胞和复杂的多极细胞。NF是神经元特异性中间纤维，是神经元胞质主要结构之一，NF免疫组化结果与NSE类似，部分细胞体与突触皆为阳性。诱导5h后多数细胞巢蛋白染色阳性，证明该细胞具有神经干细胞。GFAP免疫组化染色显示无阳性细胞，证明本研究诱导MSC分化为神经元而非星形胶质细胞。马廉等用丹参注射液诱导人的脐血MSCs后细胞形态发生明显改变，细胞表达3类神经细胞的相关标记，少量细胞表达神经干细胞标记兔抗巢蛋白抗体，40％－50％细胞表达神经元标记鼠抗BⅢ微管蛋白和鼠抗神经微丝抗体。余氏等已经证实丹参素、丹参酮可在体外成功诱导人MSC为神经元样细胞。Nestin，NSE，NF-M染色呈强阳性(棕黄色)，而未分化的MsC为阴性(蓝色)。原清涛等用隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞行神经元标志物NSE，NF的鉴定，结果显示，用隐丹参酮诱导的细胞可以呈现NSE，NF阳性，证明已经诱导为神经元样细胞。夏文杰等用隐丹参酮诱导成人骨髓间质干细胞，结果显示隐丹参酮诱导5h后，大多数细胞Nestin阳性，7h后多数细胞NSE染色阳性部分神经元拉成网状，诱导5d后NF－H染色阳性。
4 小结与展望
多能干细胞范文第5篇
近年来随着肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC；或Tumour stem cells,TSC)在肿瘤组织中分离成功，并提出了肿瘤干细胞学说，为肿瘤研究提供了新的思路。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，均具有自我更新能力和不定向分化潜能，并可导致肿瘤发生。现认为肿瘤干细胞是肿瘤形成及其不断生长的根源。
1 肿瘤干细胞的分离及鉴定
1997年Bonnet等[1]首次确认了人类急性髓性白血病中肿瘤干细胞的存在，并成功分离出来。研究发现只有0．2%~1%的细胞亚群有持续的克隆形成能力,与造血干细胞有相似的表型，即CD34+CD38-Thy-细胞,这种细胞移植到NOD/SCID小鼠后能形成类似AML的肿瘤细胞。
Al-Hajj[2]和Clarke[3]等首次从人类乳腺肿瘤中分离出了肿瘤干细胞，即CD44+CD24-/lowLin-细胞，只需100个即能100%形成肿瘤，CD44+CD24+细胞不能形成肿瘤。这是首次在实体瘤中发现肿瘤干细胞的存在。
Ignatova[4]等在人类脑部肿瘤中发现了CD133+肿瘤干细胞，为肿瘤干细胞的存在再次提供了强有力证据。Singh等[5]从人脑瘤中分离出CD133+和CD133-脑瘤细胞，只有CD133+的肿瘤细胞才能在体外培养中形成肿瘤球，具有较强的自我更新能力及增殖致瘤能力，仅需100个细胞就可以使NOD/SCID小鼠形成新的肿瘤，并能连续传代致瘤。而CD133-的肿瘤细胞数量虽占多数，却不能使小鼠形成肿瘤。
Houghton等[6]研究发现在慢性螺旋杆菌感染时，骨髓来源的干细胞会聚到胃黏膜处，并不断增殖，久之发生化生、不典型增生及癌肿。
Baumann等[7]发现肝癌干细胞不仅可分化为肝细胞癌,还可能为胆管细胞癌,或者两者皆有的混合型肿瘤。原发性肝癌在早期阶段受阻则表现为低分化肝癌，其表型介于肝细胞癌与胆管细胞癌之间；而在后期阶段受阻则表现为肝细胞癌或胆管细胞癌。肝癌干细胞不同分化阶段和不同程度的分化受阻，决定了肝癌的病理多态性。
Heidt等[8]用人胰腺癌组织制成的细胞悬液中，候选干细胞标志CD44、CD24和ESA的表达率为3%~8%，在传代细胞中亦保持较为恒定的比例。以CD44、CD24和ESA为表型分选细胞分别在6/9和3/11只小鼠中成瘤，而未分选的细胞需相应分选细胞数量的100倍始有肿瘤生长。因此认为，CD44、CD24和ESA是胰腺腺癌肿瘤干细胞的标志。
Collins等[9]从前列腺癌组织中成功分离出表面标志为CD44+/α2β1 hi/CD133+的肿瘤细胞,这种表型的细胞占来源恶性肿瘤细胞的0．3%~1．6%，具有克隆增殖及高度致瘤性，因此认为，CD44+/α2β1 hi/CD133+表型细胞即为前列腺癌干细胞。
Kondo等[10]发现体外长期培养的肿瘤细胞系中也存在类似的肿瘤干细胞，称为边缘细胞群(side population,SP)。这种SP细胞具有干细胞的特点，能够将外源性的染料转运出细胞而自身不被染色,普通细胞表面没有这种转运蛋白的存在而被染色。并在C6神经胶质瘤细胞系、MCF7人类乳腺癌细胞系、B104神经母细胞瘤细胞系、Hela细胞系中分别找到了SP细胞，其含量0．4%~2．0%不等。
另外在室管膜瘤、皮肤癌、甲状腺癌、膀胱癌及肺癌等[11]也相继发现了与正常干细胞相似表型的肿瘤干细胞。
2 肿瘤干细胞的生物学特点
肿瘤干细胞具有以下几个特点：①无限的自我更新能力。肿瘤干细胞能够产生与上一代完全相同的子代细胞，并通过自我更新维持着肿瘤的持续生长；②分化潜能，肿瘤干细胞能够产生不同分化的子代瘤细胞,在体内形成新的肿瘤；③高致瘤性，即很少量的肿瘤干细胞即能在体外培养生成人集落，很少量的肿瘤干细胞注入实验动物体内即可形成肿瘤，而一般肿瘤细胞形成肿瘤非常困难，或需要大量细胞；④耐药性，肿瘤干细胞膜上多数表达ATP-bindingcassette(ABC)家族膜转运蛋白，这类蛋白大多可运输并外排包括代谢产物、药物、毒性物质、内源性脂类物质、多肽、核苷酸及固醇类等多种物质，使之对许多化疗药物产生耐药[12]。目前认为肿瘤干细胞的存在是导致肿瘤化疗失败的主要原因。
3 肿瘤干细胞的起源
关于肿瘤干细胞的起源目前有不同的观点和学说。但大多数学者支持来源于正常干细胞的观点，认为肿瘤的发生是因为体内干细胞分化过程的停滞和阻断，细胞失去正常调控而停止在分化的某一阶段无限增殖形成。肿瘤干细胞的形成也是一个多阶段的过程，也就是基因突变的捕获及累积的过程，包括遗传学及表遗传学的改变。
3．1 正常干细胞在特定的分化阶段停止分化或分化失常 正常干细胞存活时间长，有较多机会突变，并且可将突变传给子代细胞。肿瘤干细胞与正常干细胞有许多共同的特性：①二者均具有自我更新和无限增殖能力；②均有较高的端粒酶活性以及扩增的端粒重复序列，而人类终末分化体细胞不具或具有极低的端粒酶活性；③正常干细胞具有迁移的特性，肿瘤干细胞具有转移的能力;④二者有许多相似的生长调控机制，如Wnt,Shh,Notch途径。正常干细胞在体内分化过程中受阻，细胞失去正常调控而停止在分化的某一阶段并无限增殖，最后形成肿瘤。
根据胚胎干细胞能生成畸胎瘤的事实，提示正常干细胞与肿瘤发生很可能存在着密切的关联。
3．2 成熟细胞的去分化 Uhrbom等[13]研究证实:缺失肿瘤抑制位点INK4a-ARF后，已分化的星形胶质细胞可去分化为神经前体细胞，在致癌因素条件下很容易产生恶性转化引起神经胶质胚细胞瘤，由此看来，已分化成熟的细胞在某些关键基因突变的情况下也可能发生细胞的恶性转化，并变成肿瘤干细胞而获得成瘤能力。另外，成熟细胞甚至可以通过不对称核出芽分裂方式使细胞逃避衰老和凋亡而重新获得自我更新的能力。
3．3 融合细胞学说 细胞融合是从酵母到人类所有生物体发育和生理活动所必须的。当干细胞和分化细胞融合后，融合细胞就具有干细胞特性。Bjerkvig等观察到在病理条件下，干细胞和已经出现肿瘤相关基因突变的细胞发生融合而成为肿瘤起源细胞。融合给予细胞更多去分化机会和对致瘤因子更易感，并重新获得自我更新能力，在增殖中形成肿瘤。越来越多的证据表明细胞融合可能与肿瘤发生密切相关。例如来源于移植肾的干细胞可迁徙到皮肤，通过分化或融合获得角化细胞表型,并转化成肿瘤。在人的成神经管瘤和多形性胶质母细胞瘤的肿瘤干细胞中观察到染色体的紊乱也可能是由细胞融合引起的。细胞融合后的去分化或转分化在肿瘤发生的起动、形成和进展期均可发生。
3．4 微环境与肿瘤干细胞的发生 微环境对于干细胞定位、增殖和分化具有关键意义，甚至决定干细胞的分化方向。细胞的增殖水平与分化方向要接受外界信息的指令。慢性组织损伤是肿瘤发生的原因之一,吸烟、饮酒、胃溃疡、胃酸反流、炎性肠炎等因素均可引起损伤组织的不断更新,干细胞长期处在细胞分裂和信号传导途径的激活状态，如果无法还原到静止期，干细胞就发展成为了肿瘤干细胞。畸胎瘤细胞注入鼠囊胚内细胞团可以形成正常胚胎。基因型正常的胚胎干细胞向同系小鼠腹腔移植可产生极度恶性的肿瘤。上述结果提示正常干细胞，在异常微环境下可转变为肿瘤干细胞。
6 研究肿瘤干细胞的意义
随着肿瘤干细胞在更多的不同肿瘤组织中分离成功，更有力的证明了肿瘤干细胞的存在，同时为深入探讨肿瘤的发生、发展及评价预后等提供了新的理论依据，同时也为肿瘤的治疗带来了新的思路。研究发现前列腺癌转移的病灶、含前列腺癌干细胞数量明显高于原发病灶比例，提示肿瘤干细胞越多，越容易出现转移，预后越差。乳腺癌也有类似情况。说明肿瘤干细胞与肿瘤的转移及预后有关。由于肿瘤干细胞的耐药性及大多处于休眠状态，传统的肿瘤化疗药物只对正在分裂的肿瘤细胞有效，不能有效杀灭肿瘤干细胞，最终导致肿瘤复发、转移和治疗失败。因此，只有杀灭肿瘤干细胞，才能达到根治肿瘤的目的。
根据肿瘤干细胞的特点，以及对微环境的要求，可通过对微环境的改变，来诱导肿瘤干细胞的分化及凋亡，抑制肿瘤干细胞的增殖。寻找诱导分化的药物。Jin等报道针对黏附分子CD44的单克隆抗体可显著减少人AML小鼠模型体内白血病细胞的增殖，其可能机制是通过改变维持干细胞特性的微环境从而诱导肿瘤干细胞的分化。最近等实验发现，雷帕霉素不仅可以抑制白血病起始细胞，而且有助于恢复正常造血干细胞的功能。分离鉴定不同肿瘤患者的肿瘤干细胞的特异性标志物，为肿瘤的个体化治疗提供可能。通过对肿瘤干细胞的形成、分化、转移等多方面来设计靶向治疗药物，是今后研究肿瘤治疗的一个重要的方向。
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