本文作者：朱斐1吕梦园1许梓荣2作者单位：1浙江农林大学林业与生物技术学院2浙江大学动物科学学院

结果与分析

1WSSV感染后螯虾的死亡率及PCR检测结果

WSSV口服感染螯虾15d后，投喂病虾组螯虾的死亡率达到90%。而对照组未出现死亡。PCR检测结果显示投喂病虾组的病毒阳性检出率为100%(30/30)，而阴性对照组的阳性检出率为0%(0/20)。死亡率=死亡个数/总个数×100%。PCR检测结果显示，病死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、淋巴六种组织的PCR结果均为WSSV阳性，而对照组健康螯虾的各组织PCR检测结果均为阴性。光镜和电镜观察也发现与健康螯虾比较病死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、淋巴等组织均发生了不同程度的病变并发现有WSSV病毒粒子存在。

2组织病理学分析

对照组健康螯虾肝小管外壁由单层扁平细胞包围，各肝小管之间有结缔组织与脂肪组织包裹与分隔，并伴有血管分布(图2a-1)。攻毒濒死螯虾的肝胰腺组织病理学变化十分明显，光镜下可见肝胰腺组织广泛受损，吸收与分泌细胞大量地解体并空泡化(图2a-2)。肝小管的管腔扩大或破裂，肝小管之间的结缔组织发生缺失，脂肪细胞大量溶解，血管大多破碎。对照组健康螯虾的肌肉组织肌纤维规则均匀，细胞核大小一致分布均匀，未发现异常症状(图2b-1)。而攻毒濒死螯虾的肌肉组织呈现波浪化纹理，细胞核大量减少，且固缩变形(图2b-2)。健康螯虾的中肠内壁为高柱状上皮组织，具纤毛刷状缘，肠内壁向肠腔突起许多皱褶。肌肉层与肠内壁之间有大量结缔组织与脂肪组织填充(图2c-1)。与健康螯虾的中肠组织相比，攻毒后濒死螯虾的中肠组织病变主要表现为肠内壁高型柱状上皮组织严重损伤和坏死，上皮细胞大量萎缩、细胞核大量减少，脱落高型柱状上皮组织与结缔组织相剥离，攻毒后期肠腔中可发现有崩落的上皮组织块、坏死的上皮细胞和大量的空白区域(图2c-2)。性腺和心脏也被认为是WSSV感染的主要器官，光镜下攻毒螯虾的性腺和心脏组织细胞核肿胀，核浓染并固缩，细胞致密变化，细胞排列杂乱无章，界限消失(图2d，e-2)。而在对照健康螯虾的两种组织内细胞排列有序，细胞界限分明，细胞器完整(图2d，e-1)。对照组健康螯虾的鳃组织细胞分布均匀，细胞器十分完整，细胞核很规则，染色质分布均匀(图2f-1)。而攻毒后濒死螯虾的鳃组织发生严重病变，核染色质发生碎裂、边缘化，核仁的形态很模糊，细胞的分布也不均匀(图2f-2)。在光镜下发现，健康螯虾的血淋巴中含有大量的颗粒细胞和透明细胞，细胞结构完整，分布均匀。而攻毒螯虾的血淋巴中透明细胞和颗粒细胞消失，只有少量细胞碎屑，细胞核碎片化(图3a，b)。透射电镜下观察从病虾体内抽取的血淋巴，发现有WSSV粒子存在于血淋巴里(图3c)。电镜观察发现，在攻毒螯虾体内，肝胰腺组织内细胞器的大量损伤、坏死使细胞质中呈现大片空洞，在肝胰腺细胞内未发现病毒粒子，但周围的结缔组织内却发现大量病毒粒子(图4a)，说明病毒粒子主要侵染结缔组织。肌肉的结缔组织内出现少量的病毒粒子，大量结缔组织空泡化(图4b)。攻毒后螯虾的中肠组织病变主要表现为上皮细胞大量萎缩，细胞核大量减少，细胞内有大量的病毒粒子，并伴随着细菌的大量滋生。说明螯虾在受到病毒侵染后，自身机体的抵抗力下降，细菌乘机在肠道细胞内繁殖(图4c)。鳃组织被严重感染，大量的病毒在细胞内增殖，细胞膜内外可见大量的黑色粒子，染色质消失，细胞核膨胀，细胞质崩溃(图4d)。

讨论

与对虾感染白斑综合征病毒不同的是，克氏原螯虾感染后的死亡率为90%，而阳性检出率却是100%，说明有10%的螯虾是存活的白斑综合征病毒携带者。现有的研究成果也表明，克氏原螯虾是南美白对虾白斑综合征病毒的中间宿主和越冬宿主，也就是说池塘里的克氏原螯虾能携带白斑综合征病毒钻洞过冬，并且在来年再传染给南美白对虾［8］。因此在实际养殖生产中，特别是发生过白斑综合征病害的池塘，要充分利用冬闲处理的时机，彻底清除池塘里的克氏原螯虾。有研究指出WSSV先感染宿主血细胞，再通过血液循环将病毒粒子传播到宿主体内的其它组织［9］。本研究也发现WSSV可以感染螯虾的血细胞，并使血细胞大量减少，这与李钫等［10］的研究结果相同。WSSV感染的细胞主要分布在外胚层和中胚层起源的组织，如表皮、鳃、肌肉、前肠、后肠、胃、性腺、淋巴组织、心脏、触角腺以及神经系统的相关细胞等［11-13］。由于甲壳动物特殊的摄食方式，感染WSSV病虾的肌肉等组织很容易被其它甲壳动物摄食并在水中释放出病毒粒子，病毒粒子可以经鳃部感染宿主，而鳃也被公认是WSSV感染较严重的部位。本研究也发现WSSV在鳃组织的细胞内大量增殖，同时中肠的细胞内也发现有WSSV的大量增殖，中肠是螯虾肠道中与消化、吸收密切相关的部位，也被认为是WSSV感染螯虾的主要部位［14］。