本文作者：杨青青1,2李晓云2陈健2彭翼飞2马文丽2郑文岭1,2作者单位：1上海大学生命科学院2南方医科大学基因工程研究所

STAT6-ORF和STAT6-RNAi载体构建成功

应用高保真酶和自行设计的引物进行PCR扩增，结果显示成功扩增了STAT6基因ORF的全长片段2544bp；测序结果表明扩增的STAT6-ORF没有发生突变（因序列过长，本文未予列出）。将STAT6-ORF片段连接至pLVTHm载体后，通过ClaⅠ和MulⅠ双酶切，获得大小与STAT6-ORF相符的片段（约2500bp片段）（图1A）；测序结果也显示插入序列无碱基突变，表明成功构建过表达载体pLVTHm-STAT6-ORF。采用化学合成方法合成STAT6-RNAi片段，将其连接至pLVTHm载体后，挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定。测序结果显示，插入片段无突变（图1B），表明成功构建抑制表达载体pLVTHm-STAT6-RNAi。

STAT6-ORF和STAT6-RNAi载体的慢病毒包装及报告子的验证

分别将pLVTHm空表达载体、pLVTHm-STAT6-ORF过表达载体或pLVTHm-STAT6-RNAi抑制表达载体与辅助质粒psPAX2和PMD2.G共转染到293FT细胞中进行慢病毒包装。荧光显微镜检测结果显示，3个载体的感染效率均在80%以上（图2）。收集病毒上清液进行病毒颗粒浓缩，pLVTHm空病毒组、STAT6-ORF转染组和STAT6-RNAi转染组慢病毒颗粒的病毒效价分别为3.0×107、2.7×107和4.1×107pfu/mL，证实这3个载体均可用于感染RKO细胞。

病毒感染RKO细胞后STAT6表达的变化

通过50μg/mLTET筛选及25μg/mLTET维持培养，获得了感染STAT6-ORF或STAT6-RNAi慢病毒的RKO稳定细胞株。RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果表明，感染pLVTHm-STAT6-ORF或pLVTHm-STAT6-RNAi慢病毒载体的RKO细胞中STAT6mRNA和蛋白的表达水平较对照组明显升高或降低。由此说明，本研究成功获得了STAT6过表达和抑制表达的RKO细胞（图3）。

STAT6过表达及抑制表达对RKO细胞增殖的影响

在光学显微镜下观察细胞形态学，发现组成型表达STAT6-ORF的RKO细胞增殖变化不明显，但从第2代开始，细胞增殖速度提高；转染了pLVTHm-STAT6-RNAi的细胞增殖减缓，随着培养时间的延长及细胞的传代（待RKO细胞传至第3代时，绝大多数细胞已死亡），细胞逐渐崩解，发生漂浮死亡（图4A）。CCK8法检测结果显示，与感染第1代（病毒感染细胞0h）的细胞活性相比，过表达STAT6-ORF的RKO细胞的活性增强并不明显（F＝0.650，P＝0.609）；而转染STAT6-RNAi的RKO细胞的活性从第2代开始下降，其第3代和第4代细胞的活性均显著低于第1代（F＝290.114，P＜0.001）（图4B）。

STAT6过表达及抑制表达对RKO细胞迁移的影响

Transwell小室实验结果（图5）表明，正常培养的RKO细胞具备迁移能力；当过表达STAT6-ORF后，细胞迁移能力提高，尤其是转染后48h时差异显著（F＝573.568，P＜0.01）；而转染STAT6-RNAi后，细胞迁移能力显著下降（F＝103.274，P＜0.01）。

Jak-STAT信号通路是细胞内除Ras-MAPK之外另一条重要的肿瘤相关信号通路[5]，迄今为止已发现关键分子STAT家族中的7个成员，包括STAT1、2、3、4、5a、5b和6[6]。转录因子STAT6可被IL-4和IL-13所激活，IL-4/IL-13介导重叠的生物功能，其膜受体有2种，一种是IL-4Rα，另一种是IL-13Rα1，后者为低亲和结合受体[7-9]。在免疫细胞中，STAT6是IL-4介导辅助性T细胞2（helperTcell2，Th2）分化所必需的上游转录因子。IL-4可激活STAT6的表达，STAT6在细胞质中通过磷酸化激活后转位至细胞核，结合特异启动子元件DNA位点（5’-TTCN4GAA-3’），继而启动下游基因的表达[10-12]。STAT6启动的下游基因包括细胞膜表达分子CD23、MHCclassⅡ和IL-4Rα等[3,13]。同时，激活的STAT6还可下调炎性反应因子IL-12和TNF-α等的表达。有研究发现，STAT6基因敲除的Th2细胞与IL-4Rα缺失的Th2细胞具有相似的表型，即缺乏分化的Th2细胞[14,15]。在肿瘤细胞中，激活的STAT6具有抗肿瘤作用，如原发性或转移性乳腺癌荷瘤小鼠缺失STAT6可导致肿瘤细胞逃离免疫监督[14,15]。然而，进一步的研究发现STAT6在多种肿瘤细胞中表达异常，包括前列腺瘤[16]、T细胞淋巴瘤[17]、霍奇金淋巴瘤[18]、结直肠癌[19]和原发性纵隔腔大B细胞淋巴瘤[20]。Li等[21]发现人结肠癌细胞株HT-29可自发性表达Th2细胞因子基因（例如：IL-4、IL-13、GATA-3、CDK4、CD44v6和S100A4），促进肿瘤细胞的分裂和转移，并拮抗肿瘤细胞的凋亡；而在人结肠腺癌细胞株Caco-2中，IL-4/STAT6信号通路失活，即IL-4不能激活STAT6，肿瘤细胞倾向于自发性表达Th1和Th17细胞因子基因（例如：IFNγ、TNFα、IL-12A、IL-17、IL-23、T-bet、CDKN1A、CDKNIB、CDKN2A和NM23-H1），可影响细胞周期，抑制肿瘤细胞迁移，并诱导肿瘤细胞凋亡[21,22]。上述研究结果表明，IL-4/STAT6信号通路基因激活与否与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。本研究构建了带有GFP标志的STAT6-ORF/STAT6-RNAi表达载体，并将其包装成慢病毒颗粒，感染人结肠癌RKO细胞株，结果表明成功构建及包装了STAT6-ORF和STAT6-RNAi的慢病毒表达载体，通过病毒颗粒感染RKO细胞并获得了稳定表达的细胞株。本研究发现，STAT6-ORF转染的RKO细胞的增殖速度加快并不明显（P＝0.609），但细胞迁移能力却明显增强（P＜0.01）；STAT6-RNAi转染的RKO细胞活性显著降低（P＜0.001），迁移能力也显著减弱（P＜0.01）。总之，本研究通过STAT6基因过表达及抑制表达实验，发现STAT6可能是促进结肠癌细胞增殖和迁移的重要转录因子。在此基础上，本课题组将进一步探讨STAT6促进结肠癌细胞增殖和迁移的分子机制。