本文作者：范维伟孙慧君蔡超俊袁玮韩国柱作者单位：大连医科大学药学院

实验部分

1外源性PCr对小鼠全脑永久性缺血损伤的影响

(1)动物分组、给药及模型制备:小鼠60只，随机分为对照组、PCr高剂量组(4．5g•kg－1)、PCr低剂量组(1．5g•kg－1)，每组20只。腹腔注射给药，容量0．1mL•10g－1体重，对照组给予等容量NS。于给药20min后用大组织剪沿小鼠双耳连线下部快速断头，制备全脑永久性缺血模型。

(2)标本处理及指标测定:每组取10只于断头即刻记录张口喘息持续时间。另10只于动物断头20s取大脑，一侧半球制备10%脑组织匀浆，严格按照试剂盒说明书测定蛋白浓度(考马斯亮蓝法)、SOD活力(黄嘌呤氧化酶法)及MDA含量(TBA法)。另侧脑半球经10%福尔马林固定，常规制备石蜡片HE染色。

2外源性PCr对小鼠全脑缺血再灌注损伤的影响

(1)实验分组、给药及模型制备:小鼠50只，随机分为假手术组、模型组、PCr高剂量组(2．0g•kg－1)、低剂量组(1．0g•kg－1)组及尼莫地平(Nim)组，每组10只。NS及PGr分别以0．1mL•10g－1体重于首次缺血即刻1次尾静脉注射，Nim组术前2d始灌胃给药，2次/d，每次100mg•kg－1体重，手术当天术前30min末次给药。按文献［2］方法，小鼠麻醉，双侧颈总动脉(CCA)完全阻断血流10min，复灌10min，重复3次，制备全脑缺血再灌注损伤模型。假手术组仅暴露CCA，不进行缺血再灌操作。不同处理组小鼠分别于末次再灌2h后断头取脑。

(2)标本处理及指标测定:每组取10只小鼠左侧大脑测定脑组织含水量(干湿重法)脑含水量(%)=(湿重－干重)/湿重×100WesternBlot法测定CD14蛋白表达:每组取6只小鼠右侧大脑组织经裂解液充分裂解后，4℃离心取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度。12%SDS－PAGE分离胶，5%SDS－PAGE浓缩胶。样品经处理后上样，电泳、PVDF膜转膜(恒流0．8mA/cm，室温，48min)，5%脱脂奶粉封闭。Rabbitanti－RatCD14(1∶250)以及β－Actin抗体(1∶1000)孵育过夜(4℃)，二抗(1∶5000)37℃水浴孵育2h。ECL暗室显色，凝胶成像系统拍照后Gel－ProAnalyzer4．0软件分析。

3统计学方法

应用SPSS11．5统计软件进行分析，数据用均数±标准差(x±s)表示。两组间均数采用t检验;多组间均数样本比较采用One－ANVOA方差分析;两两比较采用q检验，P＜0．05认为差异有显著性意义。

结果

1外源性PCr对小鼠全脑永久性缺血损伤的影响高剂量

PCr可延长小鼠永久性全脑缺血后张口喘息持续时间、增加脑组织中SOD活力，与对照组比较P＜0．05。高、低剂量组小鼠脑组织中MDA含量均明显低于对照组(P＜0．05)，见表1。

2外源性PCr对小鼠GBI/R损伤的影响

(1)外源性PCr对脑含水量的影响:与假手术组比较，GBI/R模型组脑含水量升高明显(P＜0．05);给予外源性PCr及Nim处理后脑含水量低于模型组，差异具有显著性意义(P＜0．05)，见表2。

(2)外源性PCr对脑组织中CD14蛋白表达的影响:WesternBlot法检测显示小鼠GBI/R后脑组织CD14蛋白表达明显升高。不同剂量PCr处理可明显降低CD14升高的程度。见表2，图1。

(3)对脑组织病理变化的影响:经组织切片HE染色镜下观察，结果显示假手术组神经细胞大小、形态结构完整，核大而圆无固缩，间质均匀致密;模型组可见大量神经细胞变性，胞核固缩、深染，细胞周围间隙结构松散，出现大量空泡，PCr及Nim给药组与模型组相比病变程度均明显减轻。见图2。

讨论

急性脑缺血是临床上常见的脑血管疾病之一，能量代谢障碍是导致细胞损伤的触发因素，有效提供能量是缺血早期治疗，减轻组织损伤的关键。本研究所用小鼠脑缺血性损伤模型具有良好的重现性，损伤指标明确。磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是体内高能磷酸化合物的储存形式，其分子中含高能量的氨基磷酸键，在细胞中水解可产生超过12000kal/mol能量，是细胞的重要能源物质［3］。在组织大量消耗ATP，导致ADP增多时，PCr可将其磷酸键转移给ADP生成ATP以补充能量的供应，在生理及应激条件下通过此反应维持机体能量代谢的动态平衡［4－5］同时具有稳定磷脂膜、保护细胞免受自由基过氧化损害等作用［6］。近期有研究认为，PCr的作用方式可能有以下两方面:(1)通过PCr分子起作用，其含有的高能磷酸键参与能量代谢，使ATP生成增加;(2)通过其体内代谢产物肌酸(creatine，Cr)发挥作用，在这种情况下，PCr作为Cr的一个前体药物或载体而发挥作用［7］。脑缺血时可产生大量氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，引起细胞损伤。此过程生成的MDA等脂质过氧化物的分解产物亦可造成细胞损伤。SOD清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。将MDA与SOD配合测定，以反映机体氧化损伤和抗氧化能力是本类研究常用方法。诸多研究已证实，急性脑缺血时因中枢神经功能障碍导致植物神经功能紊乱，加之机体发生应激反应导致肠黏膜屏障功能受损，细菌移位、大量内毒素释放并诱导细胞表面受体(CD14)表达增多，参与并加重组织损伤，甚至触发多器官功能障碍综合征的发生。本研究结果显示外源性PCr可明显延长全脑永久性缺血后张口呼吸时间;减轻脑水肿及损伤后脑组织形态学改变。显示外源性PCr可有效缓解脑缺血性损伤，维持脑功能。而降低组织MDA含量、提高SOD活力;抑制损伤后CD14表达则提示PCr抗脑缺血性损伤作用可能通过增加供能、稳定细胞内腺苷酸池，稳定磷脂膜等机制，进而提高组织抗氧化性损伤能力及降低继发性内毒素攻击、保护细胞有关。本研究在一定程度上证实了在脑缺血早期给予外源性PCr可有效减轻脑组织缺血及缺血再灌注损伤，维持脑功能，并有可能减轻脑损伤继发的其他组织器官损伤。为临床用药提供了实验和理论依据。