本文作者：张华丹1余辉1陈小娥1郭维平2方旭波1作者单位：1.浙江海洋学院食品与药学学院2.浙江正龙食品有限公司

金枪鱼是一种富含DHA、营养价值高、纯天然、无污染等优点而享誉国际市场并有“海洋黄金”、“海底鸡”之称，其消费主要以生鱼片和罐头为主，但其加工中产生大量的下脚料，约占其总质量的50%~70%[1]。金枪鱼鱼油是金枪鱼下脚料综合利用的1个重要部分[2]，而且其DHA与EPA的比例是5:1，DHA的含量高，EPA的含量低，故适合儿童和青少年使用。因此，从金枪鱼下脚料中提取金枪鱼鱼油具有广阔的前景和可观的经济效益[3]。

传统生产鱼油的方法有蒸煮压榨法、淡碱水解法、溶剂法等，但都存在着各自的不足[4]。而酶法提油工艺因具有作用条件温和，避免使用有机溶剂，营养物质损失小等优点而备受国内外关注。目前，国内外关于酶法提鱼油研究较多[5-15]，可有关双酶法提鱼油的研究较少[16-17]，特别是采用双酶法对水产加工下脚料中鱼油的提取研究却未见报道。同时，前期研究发现，在酶法提鱼油过程中会形成稳定乳状液，从而造成鱼油回收率低；而且鱼油中含有大量易氧化的EPA、DHA等不饱和脂肪酸，采用通常的调pH值-保温破乳的方法势必会影响鱼油的品质，因此，如何在保证鱼油品质同时提高鱼油回收率是当前酶法提鱼油工艺中急需解决的问题。目前，有研究者[18]采用冷冻解冻破乳方法对酶法提花生油中乳状液进行破乳的研究，乳状液中油回收率达到91.6%，而国内外关于酶法提鱼油中乳状液破乳的研究却鲜有报道。本试验以金枪鱼下脚料为原料，对双酶法提油及破乳工艺进行研究，为金枪鱼下脚料的开发利用提供一定的理论参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

金枪鱼加工下脚料：浙江兴业集团有限公司；碱性蛋白酶A(酶活100000U)、酸性蛋白酶B(酶活50000U)：无锡市雪梅酶制剂科技有限公司；盐酸、氢氧化钠等：试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；501型超级恒温水浴：金坛市文华仪器有限公司；JB-2型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司；FE20K型酸度计、EL303型电子分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DL-5低速大容量离心机：上海安亭仪器制造厂；HH-S2电热恒温水浴锅：江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；GZX-9240MBE型电热鼓风干燥器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DW-86L386型超低温冰箱：青岛海尔特种电器有限公司。

1.3鱼油提取

金枪鱼下脚料经清洗、去胆与杂物等预处理，于组织捣碎机中搅碎，冻结保存。称取一定量上述处理的样品放入酶反应器中，加入一定量水，调节pH与温度，分别加入蛋白酶A和B，水解一定时间后所得酶解液在-20℃冻结15h，35℃解冻2h进行破乳[18]，5000r/min离心20min，上层为鱼油。

1.4破乳实验

分别取相同质量的上述酶解液放入塑料螺口离心管中，在一定温度的超低温冰箱中冻结一定时间，取出，放入一定温度的恒温水浴锅中解冻一定时间，5000r/min离心20min，上层为鱼油。

1.5鱼油提取率的计算

鱼油提取率(%)=(鱼油提取质量/下脚料质量)×100

1.6鱼油理化指标测定

水分及挥发物含量参照GB/T5528—2008电热干燥箱法；酸价参照GB/T5530—2005冷溶剂法；过氧化值参照GB/T5538—2005；碘值参照GB/T5532—2008。

1.7统计分析

数据处理采用originpro7.0软件，差异显著水平P<0.05。

2结果与分析

2.1鱼油提取工艺的确定

前期试验发现，蛋白酶A与蛋白酶B在最适作用条件下，依次对金枪鱼进行水解，其粗鱼油提取率最高。因此，后续单因素试验重点考察料液比、酶添加量和反应时间对粗鱼油提取率影响。

2.1.1料液比对粗鱼油提取率的影响

蛋白酶A、B添加量都为2.0%，反应时间均为4h，酶解液经冻结解冻破乳、离心后，考察料液比对粗鱼油提取率影响，结果见图1。由图1可以看出，当料液比为1:3时，粗鱼油提取率达到最大即为4.82%，随着料液比进一步减小，粗鱼油提取率却逐渐减小。以下实验都采用料液比为1:3。

2.1.2蛋白酶添加量对粗鱼油提取率的影响

在料液比为1:3，反应时间均为4h条件下，分别考察不同的蛋白酶A添加量(蛋白酶B添加量为2.0%)和不同的蛋白酶B添加量(优化的蛋白酶A添加量)对粗鱼油提取率的影响，结果见图2。由图2可知，当两种蛋白酶添加量为1.5%时，粗鱼油提取率达到最大，分别为5.38%和5.56%，进一步增加其添加量，粗鱼油提取率却无显著变化(P>0.05)。综合考虑，均选择1.5%添加量为后续实验的酶量。

2.1.3反应时间对粗鱼油提取率的影响

在料液比为1:3，添加量均为1.5%条件下，分别考察蛋白酶A不同反应时间(蛋白酶B反应时间为4h)和蛋白酶B不同反应时间(优化的蛋白酶A反应时间)对粗鱼油提取率的影响，结果如图3所示。结果表明，当蛋白酶A和B反应时间增加到3h和2h时，粗鱼油提取率分别达5.63%和5.79%，再延长反应时间，粗鱼油提取率趋于平缓，无显著变化(P>0.05)。

2.2破乳工艺条件的确定

经酶解后，下脚料液就变成了相对稳定的乳状液体系，试验表明，冻结解冻破乳法是可行的方法，因此，本文就冻结温度与时间、解冻温度与时间对最终粗鱼油提取率的影响进行单因素试验。

2.2.1冻结温度对粗鱼油提取率的影响

在35℃解冻2h条件下，考察不同冻结温度(冻结时间15h)对粗鱼油提取率的影响，结果见图4。从图4可以看出，当温度由-10℃降低到-20℃，粗鱼油得率从4.35%升高到5.81%，继续降低温度，粗鱼油提取率却无显著变化(P>0.05)。

2.2.2冻结时间对粗鱼油提取率的影响

在35℃解冻2h条件下，考察-20℃不同冻结时间对粗鱼油提取率的影响，结果见图5。由图5可见，在冻结时间为12h时，粗鱼油提取率最大即为6.17%，此后再延长冻结时间，粗鱼油提取率却无明显变化(P>0.05)。

2.2.3解冻温度对粗鱼油提取率的影响

在-20℃下冷冻12h条件下，考察解冻温度(解冻时间2h)对粗鱼油提取率的影响，结果如图6所示。从图6看出，温度从25℃增加到40℃时，粗鱼油提取率从5.05%增加到6.82%；当温度超过40℃时，粗鱼油提取率随温度升高而趋于减小，但无显著变化(P>0.05)。

2.2.4解冻时间对粗鱼油提取率的影响

在-20℃冻结12h条件下，考察40℃不同解冻时间对粗鱼油提取率的影响，结果见图7。结果表明，当解冻时间为1.5h时，粗鱼油提取率达到最大即为6.97%，此后再延长解冻时间，提取率有下降趋势，但无显著变化(P>0.05)。

2.3验证实验

由上述试验可知，双酶酶解提油最适工艺条件为料液1:3，蛋白酶A、B添加量均为1.5%，反应时间各为3h和2h，酶解液在-20℃冻结12h，40℃解冻1.5h进行破乳。在此条件下，重复3次试验，最终获得粗鱼油呈淡黄色，稍有混浊，具有鱼腥味，且提取率为6.58±0.56%。同时，对所获得的粗鱼油理化性质进行分析，并与SC/T3502—2000鱼油标准进行了比较，结果见表1。由表1可知，采用双酶酶解法从金枪鱼下脚料中提取的粗鱼油，其理化指标基本上达到了SC/T3502—2000标准规定的粗鱼油二级标准。

3结论

本文研究了双酶酶解金枪鱼加工下脚料提油工艺，确定其双酶酶解提取粗鱼油最适工艺条件为：料液比1:3，蛋白酶A和B酶添加量均为1.5%，两种蛋白酶反应时间分别为3h和2h，酶解液-20℃冻结12h，40℃解冻1.5h时，离心后粗鱼油的提取率达(6.58±0.56)%。该工艺在较低温度下进行，较大改善了鱼油活性成分的损失，粗鱼油的理化指标均达到SC/T3502—2000的粗鱼油二级标准。