本文作者：张越己1秦盛1卞光凯1费世明2李钦1曹成亮1王乐辉2蒋继宏1

作者单位：1.江苏师范大学2.四川省林业科学研究院

麻疯树(JatrophacurcasL.)是耐旱而非食用型的油种子植物,很容易适应半干旱土壤和荒地,因此麻疯树被认为是潜在的可替代能源植物。在印度,麻疯树已晋升为该国的生物柴油资源[1]。此外,麻疯树也是重要的药用植物,其代谢产物具有抗病毒、抗肿瘤等药用价值。然而麻疯树抗寒能力较弱,因而在高海拔寒冷地区以及我国中东部的栽培与引种受到了限制。另外,近年来我国南方常遭遇连续降雪、冰冻、干旱等恶劣天气,使得麻疯树生长也面临着如何有效提高幼苗的抗寒性、抗干旱能力的严峻问题。因此,如何提高该物种在低温、干旱环境的适应性及其初期幼苗活力,建立良好的生长体系,已成为综合开发该资源必须解决的问题和实现麻疯树各种生物价值的重要途径。植物根际促生菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR)是指生存于植物根际、根表,并能间接或直接地促进或调节植物生长的微生物[2]。PGPR能够通过协助植物从环境中摄取养分来进行直接的促生作用;也能够降低恶劣环境给植物造成的伤害而间接地产生促生作用。尽管PGPR的促生机制还没有完全弄清楚,但是它多样的促生作用已被广泛接受。其促生机制主要包括:(1)产生调节植物生长的信号物质,如赤霉素、吲哚乙酸、细胞分裂素和乙烯;(2)非共生固氮;(3)产嗜铁素、抗生素和氰化物抵抗病原菌;(4)溶解磷矿物及其它养分[3]。一些PGPR也能通过影响共生固氮结瘤、结节促进植物生长[4]。另外已有的研究表明[5],存在于植物根际土壤并能产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-Aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)脱氨酶的天然细菌可以把乙烯合成的前体ACC水解成氨和α-丁酮酸,并将这两种分解产物分别作为N源和C加以利用,从而降低应激乙烯的含量,减轻逆境胁迫对植物造成的伤害,促进植物生长。因此,以ACC脱氨酶为主要指标来筛选根际促生菌用以提高植物对外界环境的适应性是个很好的切入点,具有较好的应用前景。目前,对麻疯树的研究多集中于对其资源分布、化学成分、生物柴油转化技术、生理胁迫、良种选育和繁殖技术等方面,而麻疯树根际具有ACC脱氨酶活性促生菌的研究国内外还未见报道。本文通过对麻疯树根际细菌的分离以及对菌株进行促生指标的筛选,寻找有潜在促生作用的菌株,为后续微生物提高麻疯树抗寒、抗干旱能力的研究提供菌种资源,并为植物-根际促生菌的进一步深入研究打下前期基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源:样品采自四川省攀枝花市延边县麻疯树种植基地,野生麻疯树根部及其根际土壤一并带回处理。

1.1.2培养基:细菌分离培养基:营养琼脂(NA)、LB培养基、TSA培养基、蔗糖无机盐培养基(YN)、R2A培养基、KMB培养基、1/4ISP2培养基及改良后的BPA培养基(加入200mL根际土壤浸提液)。促生筛选培养基:有氮培养基、无氮培养基、SM培养液、无机磷培养基参照文献[6]配制。以上培养基配好后置于1×105Pa灭菌20min。SMA培养基:向SM培养基中添加经滤器过滤除菌的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC),使其终浓度为3mmol/L。

1.1.3主要试剂及仪器:ACC购自Sigma公司,Taq酶及pMD-18T连接试剂盒购自TaKaRa公司,16SrRNA基因扩增引物由上海生工生物工程公司公司合成;SpectromaxM2多功能全自动定量绘图酶标仪(美国MolecularDevices),PTC200梯度PCR仪(美国MJR．I),凝胶成像仪,冷冻离心机。

1.2根际土壤中细菌的分离

称取1g土样于灭菌的50mL锥形瓶中,加入4mL灭菌水,超声(150W)15min使泥土分散,之后振荡将其混匀。取溶液于1.5mL离心管中再分别稀释102、103、104、105和106。从其中各吸取100μL于LB平板上涂布均匀。置于37°C培养箱中培养35d。待平板上出现较多单菌落时,在无菌条件下挑取菌落颜色、形态等培养性状不同的单菌落分别接种于LB斜面上保存。

1.3根际细菌促生活性的筛选

1.3.1产ACC脱氨酶能力的测定:(1)定性测定:菌株接种于SMA固体培养基,选取传代5次后能够在唯一氮源为ACC的培养基上生长的菌株为产ACC脱氨酶阳性菌株。(2)定量测定:菌株在LB培养液中培养24h,将所获得的培养物在4°C下以8000r/min离心10min,之后收集菌体,用SM培养液洗涤离心2次,菌体悬浮于SMA培养液,在28°C旋转摇床180r/min的条件下培养24h,以诱导产生ACC脱氨酶。4°C离心收集菌体,用0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.6)洗涤离心2次,重新悬浮于600μL0.1mol/LTris-HCl缓冲液中(pH8.5),然后加入30μL甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞。ACC脱氨酶活性的测定方法参照Honma[7]和Saleh[8]的方法,于540nm下测定其OD值。ACC脱氨酶的单位酶活为在测酶体系中以1μmol/min的速率形成α-丁酮酸的活性。蛋白质测定采用Bradford比色法[9],以牛血清蛋白为标准绘制标准曲线,计算得到线性方程。ACC脱氨酶酶活单位为μmolα-KA/(mg•h),各菌株酶活性测定均扣除样品对照中自发产物后计算。

1.3.2产生长素(IAA)能力的测定:(1)定性测定:向含有氮元素培养液中添加除菌后的色氨酸溶液,使色氨酸浓度最终达到0.5g/L。挑取菌株接种于上述培养液中,37°C摇床培养24h,用无菌枪头吸取1mL菌液于无菌离心管中,加入2mLSackowcki’s显色剂[10]之后迅速充分混合,室温下避光显色20min。出现粉红色为阳性,说明有IAA产生。(2)定量测定:阳性菌株避光放置30min,测定其OD530值。通过IAA浓度与OD530的线性方程计算相应的IAA浓度,每组实验重复3次。各菌株IAA含量测定均扣除样品对照中自发产物后计算。

1.3.3固氮能力测定:将菌株接种于无氮培养基,37°C培养38d观察其生长情况,转接5次。

1.3.4解磷能力测定:将菌株接种于无机磷培养基,37°C培养38d,观察有无溶磷圈。1.3.5产铁载体能力测定:将菌株接种于CAS检测培养基,37°C培养23d,观察培养基上有无形成橙色铁载体分泌圈[11]。

1.4根际细菌16SrRNA基因序列的测定以及系统发育分析

分离菌株总DNA的提取参照文献[12]的方法进行;PCR扩增采用细菌16SrRNA通用引物[13],27f:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′;1492r:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反应条件为:94°C5min;95°C1min,55°C1min,72°C90s,共35个循环;72°C10min。PCR产物用经EB染色的0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后测序。依照测序结果,从NCBI(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和EzTaxon()数据库中调出相似性较高的相关菌株16SrRNA基因序列,分别用ClustalX2.0及MEGA5.0[14]软件进行序列比对分析,最后用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树,并做系统发育分析。

2结果与分析

2.1土壤根际细菌的分离

在NA、LB、TSA、YN、R2A、改良后的BPA、KMB及1/4ISP2这8种培养基上涂布混合的土壤悬液,共分离得到98株细菌,根据菌落颜色、形态、大小等特征初步去重复后获得28株细菌,继而对这28株细菌进行促生潜在性评价。

2.2内生细菌的促生长潜力

从表1中可以看出,28株供试菌株中有15株具有固氮的能力,占总菌株的54%;9株具有解磷的能力,占总菌株的32%;仅有2个菌株能产生铁载体,占总菌株的7%;有19株菌可以产生IAA(68%),其中KLBMP4820、KLBMP4806、KLBMP4807及KLBMP4804产IAA的含量分别高达57.063±0.016、50.811±0.001、54.467±0.017及50.439±0.015mg/L。在之前的ACC脱氨酶活性定性筛选中,经5次传代后有13株(46%)细菌仍能够在SMA固体培养基上正常生长,这说明他们具有ACC脱氨酶活性。据文献报道,当ACC脱氨酶酶活不低于20nmolα-KA/(mg•h)时,就可促进植物的生长[15]。通过进一步的定量检测显示,13株菌的ACC脱氨酶酶活均高于20nmolα-KA/(mg•h)。而菌株KLBMP4801、KLBMP4828、KLBMP4803、KLBMP4802以及KLBMP4806和KLBMP4804的ACC脱氨酶酶活较高,最高达到128.308±0.577μmolα-KA/(mg•h)。另外KLBMP4801、KLBMP4802、KLBMP4804、KLBMP4806、KLBMP4821,KLBMP4826和KLBMP4828这几株菌同时具有产ACC脱氨酶及IAA的能力,且与之前一些研究相比,IAA含量和ACC脱氨酶含量都有所上升。值得关注的是,本研究获得的KLBMP4821菌株属于窄食单胞菌属,而有研究表明,该属的大部分细菌能够在宿主植物中定殖并对植物具有促生等有益作用[16]。KLBMP4803、KLBMP4808和KLBMP4810这几株菌也有较高的ACC脱氨酶酶活,但并无产IAA的能力。而KLBMP4807、KLBMP4820和KLBMP4827等几株菌产IAA的含量较高,却不具备产ACC脱氨酶的能力。综合几个促生指标的检测结果:获得了几株同时具备多个促生指标的菌株以及一些仅具单一促生指标能力但含量较高的菌株。由此推断,四川省麻疯树根际土壤中应该拥有较多具有潜在促生长作用的细菌,而这些菌株也有一定的研究价值。

2.3根际细菌16SrRNA基因序列的测定以及系统发育分析

从麻疯树根际土壤中分离后经促生指标初步筛选出的22株细菌(其中6株属于经典产丝放线菌,待进一步单独研究,因此不在本文中列出),以提取的总DNA为模板,扩增得到16SrRNA基因序列。结果显示,它们属于Firmicutes门,Proteobacteria门和Actinobacteria门的三大系统发育类群(表2)。经统计共8个属,其中有11株属于芽孢杆菌属(Bacillus),为分离菌株总数的50%,占主要地位。而其中的KLBMP4802、KLBMP4804以及KLBMP4820均为产ACC脱氨酶或IAA较高的菌株。KLBMP4806和KLBMP4816属于粪产碱杆菌属(Advenella);KLBMP4814和KLBMP4810两株菌属于节杆菌属(Arthrobacter);KLBMP4821属于窄食单胞菌属(Stenotrophomonas);KLBMP4826和KLBMP4829属于假单胞菌属(Pseudomonas);KLBMP4803属于西地西菌属(Cedecea);KLBMP4827属于产碱杆菌属(Alcaligenes)。而KLBMP4817和KLBMP4824属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus),这也充分显示了四川麻疯树根际细菌的丰富多样性。经MEGA5构建Neighbor-Joining系统进化树分析(图1)以及在EzTaxon数据库中进行有效种的16SrRNA基因序列相似性搜索后发现,其中KLBMP4817(1462bp)与该属的典型菌株相似性低于98%,与最近的标准菌株PaenibacillusfonticolaZLT相似性为97.8%,在系统发育树中(图2)又独立成一进化分支并且有较高的自举值,可能为潜在的新种。而与KLBMP4821(1454bp)的16SrRNA基因相似性高于97%的菌有6株,但从系统进化树上来看(图3),KLBMP4821只与Stenotrophomonaschelatiphaga(EU573216)、Stenotrophomonaspavanii(FJ748683)以及Stenotrophomonasmaltophilia(AB008509)同聚在一个大分支上,并有较高的自举值。同样,KLBMP4824(1455bp)与Paenibacillusgly-canilyticus(AB042938)以及Paenibacillusxinji-angensis(AY839868)聚在系统发育树的一个分支上(图4),而KLBMP4824与这两株菌的相似性分别为98.7%和97.0%。另外,经由对菌株KLBMP4817、KLBMP4821和KLBMP4824的表型及生理生化特征与各自相关的典型菌株之间的比较分析,均存在较大差异性,因此我们初步认为它们代表Stenotrophomonas和Paenibacillus属的新种,但要最终确定它们的分类地位,仍需综合各自形态特征、生理生化与化学分类特征以及与最近菌株的DNA-DNA同源性分析结果来判断,而我们也正同时进行这些新种鉴定工作的研究,相关文章将在后期发表。

3讨论

目前国内对麻疯树已经进行了大量的研究,通过对种植资源分布的调查,基本摸清了麻疯树的种植和分布地带,在此基础之上,建立了生物物质能源植物数据库。但是,麻疯树目前只自然分布于我国的热带和亚热带地区,分布范围比较有限;虽然麻疯树幼苗对盐胁迫、干旱胁迫以及低温胁迫具有一定的抗逆性,但要想在我国其它地区大面积推广栽培,就必须进一步加以研究以提高其抗逆性[17]。

研究发现,植物根际促生菌(PGPR)通常可以通过直接和间接两种方式来促进植物的生长和发育[18]。此外,PGPR还能够提高植物耐非生物胁迫的能力(如盐胁迫和干旱胁迫等)[19]。同时研究表明,ACC脱氨酶被认为能降低植物乙烯的浓度,是PGPR促进植物生长发育的主要机制之一。迄今为止,国内外已有许多科研人员报道了具ACC脱氨酶活性的植物根际促生菌能提高植物的抗极端温度胁迫和土壤pH胁迫[20],抗水涝胁迫,抗重金属胁迫,能够增加植物在盐碱环境中的成活率,延长水果保质期,有效防止病原菌对植物的伤害等[21]。本文首次对麻疯树根际具有ACC脱氨酶活性的菌株进行了分离筛选,发现在28株供试菌株中,46%的菌株能产生ACC脱氨酶,有54%的菌株具有固氮能力;32%的菌株具有解磷能力;68%的菌株能产生IAA;其中有13株菌株的ACC脱氨酶酶活超过了20nmolα-KA/(mg•h),最高含量达到128μmolα-KA/(mg•h)。比滕松山[22]报道中的ACC脱氨酶活性以及吉秀云[23]报道的IAA及ACC脱氨酶活性均有较大幅度的提升。

目前,已报道的具有促进植物生长的细菌主要包括:芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、微杆菌属(Microbacterium)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、弧菌属(Vibrio)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)[5,15,2427]等。在本文的研究中,综合ACC脱氨酶、IAA、固氮、解磷、产铁载体等5个指标及经16SrRNA基因序列分析发现,芽孢杆菌属的菌株KLBMP4802、KLBMP4809、KLBMP4804,窄食单胞菌属的KLBMP4821等都具有较强的潜在促生作用,这与之前的有关研究相符;然而本研究得到的粪产碱杆菌属的菌株KLBMP4806和KLBMP4816,节杆菌属的KLBMP4810、KLBMP4814等也具有较强的促生长潜在性,这也扩大了已知的具有潜在促生长作用的细菌种属范围。本实验室也同时运用富集定向筛选法筛选出具有ACC脱氨酶活性的菌株,但这些菌株的实际促生作用究竟如何,仍需通过进一步的盆栽试验来验证。

综上所述,四川省攀枝花市麻疯树基地土壤中不仅含有大量的细菌资源,而且具有丰富的多样性,其中不乏高促生作用的细菌类群,这不仅为我们日后研究对麻疯树有促生作用的菌株的回接提供了很好的材料,也为研究微生物对麻疯树的抗寒、抗旱、促生、抗病虫、快繁等方面提供了良好的资源。