本文作者：刘萍1郑慧玲2赵竟男3吴建伟4苏晓庆1

作者单位：1.贵阳医学院生物学教研室2.贵阳市妇幼保健医院优生遗传科3.艾迪康临床检验所有限公司4.贵阳医学院寄生虫学教研室

贵阳腐霉Pythiumguiyangense是贵阳医学院于1994年分离得到的一株灭蚊真菌[1]。经课题组实验研究证实它具有灭蚊能力强、繁殖速度快、易于人工培养[2]、可移植性强以及对非靶生物相对安全等诸多优点[34]。然而,和其它昆虫病原真菌一样,贵阳腐霉也具有毒力不稳定、击倒害虫所需时间较长、对环境依赖性强以及长期人工传代菌株退化等缺点,要将其开发成生物防治剂,真正用于蚊虫生物防治,目前还有许多工作要做。在基因工程技术广泛应用于生物遗传改造的今天,采用基因转化技术培育新菌株是可行的。

昆虫病原真菌入侵靶标昆虫过程中分泌一系列蛋白质酶、几丁质酶和脂酶等体壁降解酶降解昆虫体壁,与菌丝产生的机械压力协同作用,穿透昆虫体壁并在虫体内寄生,耗竭昆虫营养,甚至产生次生代谢产物,从而导致靶标昆虫的死亡。在此过程中,类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-likeprotease,Pr1)是降解昆虫体壁的重要参与者[5]。St.Leger将构巢曲霉组成性启动子控制下的多拷贝金龟子绿僵菌Pr1基因转入绿僵菌基因组,在烟草天蛾血淋巴中实现高效表达,增强了绿僵菌的毒力,使杀虫时间缩短了25%,并使虫体取食能力大大降低[6]。该结果表明,Pr1蛋白酶基因在绿僵菌中的超表达可以明显提高该菌的毒力。本课题组前期克隆得到1519bp的贵阳腐霉Pr1蛋白酶基因序列,其中包含一个969bp的完整的开放阅读框[7]。在此基础上,我们希望利用基因工程技术将贵阳腐霉的Pr1蛋白酶基因转入贵阳腐霉中超量表达,以期获得高毒力的工程菌。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌种与质粒:贵阳腐霉来源于贵阳医学院蚊虫生物防治实验室;根癌农杆菌LBA4404和质粒pUC18由贵州大学赵德刚教授惠赠;pSK-hph由西南大学生物技术研究中心张永军教授惠赠;pAN7-1由黄隽老师惠赠;pCambia-Pnos-PNN-hph由本实验室构建[8];引物合成与测序由上海英骏(Invitrogen)公司完成。

1.1.2蚊虫:实验所用蚊幼虫为本实验室驯化后传代饲养的致倦库蚊Culexquinquefasciatus贵阳株。

1.1.3常用培养基:KPYG2培养基(g/L):蛋白胨1.50,酵母浸出粉1.50,葡萄糖3.00,胆固醇0.025,氯化钙0.11,玉米油1.00。基本盐培养基(g/L):MgSO4•7H2O0.3,KH2PO40.3,NaCl0.3,葡萄糖5.0。诱导培养基(g/L):MgSO4•7H2O0.3,KH2PO40.3,NaCl0.3,几丁质2.0,蝉蜕2.0,pH6.0。YEP培养基(g/L):蛋白胨10.0,酵母提取物10.0,氯化钠5.0,pH7.2。IM培养基(g/L):KH2PO41.45,K2HPO42.05,NaCl0.15,MgSO4•7H2O0.50,(NH4)2SO40.50,CaCl20.07,FeSO4•7H2O0.003,C6H12O6•H2O1.80,甘油5mL,蒸馏水定容至940mL,1×105Pa高压灭菌20min,冷却后加入滤过除菌的40mL1mol/LMES和20mL10mmol/L乙酰丁香酮(AS)。

1.1.4主要试剂:Taq酶、dNTP、T4DNA连接酶、各限制性内切酶、CIAP、DNAmarker等购自TaKaRa公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、潮霉素B等抗生素购自Solarbio公司。底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA、左旋多巴(L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)等购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1贵阳腐霉Pr1基因的克隆:根据贵阳腐霉Pr1蛋白酶基因序列(序列分析无内含子)自行设计引物pr1-F:5-CGCGGATCCGACCCATTCCGAAAGTCCAAG-3,5端引入BamHⅠ酶切位点;pr1-R:5-GGAAGATCTTACAACCGTCCTCCTAACAC-3,5端引入BglⅡ酶切位点。尿素法提取贵阳腐霉基因组DNA[9],以其为模板,扩增Pr1基因片段。PCR反应条件:94°C5min;94°C45s,59°C1min,72°C1min,共30个循环;72°C10min。

1.2.2组成性表达载体pCambia-hph-Pr1的构建:用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切质粒pSK-hph,回收TtrpC片段(770bp),与用相同酶切的质粒pUC18连接转化,重组载体命名为pUC18-TtrpC。以贵阳腐霉基因组DNA为模板扩增Pr1片段,切胶回收,以限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ双酶切,得到Pr1片段(1100bp),与相同酶切的载体pUC18-TtrpC连接转化,重组载体命名为pUC18-TtrpC-Pr1。以质粒pAN7-1为模板,扩增Pgpd段(约2.1kb),回收该片段,用KpnⅠ和BamHⅠ酶切,与相同酶切的载体pUC18-TtrpC-Pr1连接,命名为pUC18-PgpdA-pr1-TtrpC。用HindⅢ单酶切pUC18-PgpdA-Pr1-TtrpC,回收约4.0kb片段,与相同酶切的pCambia-Pnos-PNN-hph连接转化。获得组成性表达Pr1的载体pCambia-hph-Pr1,冻融法转入根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensLBA4404中[10],70°C保存。

1.2.3根癌农杆菌介导的Pr1基因在贵阳腐霉的遗传转化:按龙朝钦等[11]方法稍改动。取含质粒pCambia-hph-Pr1的LBA4404过夜培养物,用含200μmo1/LAS的YEP液体培养基28°C振荡培养6h后,与贵阳腐霉菌丝混合,26°C培养24h。弃上清,加入含200μmo1/LAS的IM培养基,26°C培养48h。悬浮沉淀,将该混合物涂布到KPYG2平板上(含200mg/L潮霉素B和200mg/L头孢霉素),26°C培养直至抗性菌丝长出。

1.2.4潮霉素抗性基因hph的PCR检测:引物hphR:5-TTCGATGTAGGAGGGCGTGGAT-3;hphF:5-CGCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3。分别以贵阳腐霉野生株和转化株基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR条件:94°C4min;94°C45s,60°Clmin,72°C1.5min,共35个循环;72°C10min。

1.2.5Pr1蛋白酶活性测定:野生株和转化株分别在诱导培养基和基本盐培养基中振荡培养24h。取培养液4°C、13000r/min离心,上清液即为粗酶液。利用专一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA进行Pr1蛋白酶活性测定[12]。酶活单位定义为在pH8.0、28°C条件下,每分钟每毫克总蛋白的A410增加0.1所需的酶量。考马斯亮蓝法测定蛋白含量,计算比酶活。

1.2.6游动孢子的诱发与计数:接种贵阳腐霉于KPYG2培养基上培养7d后,30mL灭菌蒸馏水中放入直径15mm的2个菌丝块,25°C静置24h,轻摇烧瓶,取50μL液体并加入10μL棉蓝染液,混匀,放置1015min。显微镜下计数游动孢子[2]。

1.2.7生物测定－灭蚊实验:贵阳腐霉接种于KPYG2培养7d后。取塑料杯,盛入100mL水,加入25只二龄致倦库蚊幼虫和直径为15mm的2块菌丝块,加入6滴4%兔肝粉悬液。设空白对照。每天观察一次,取出死亡幼虫镜检,体内有菌丝者即为感染幼虫;无菌丝者保湿培养24h再镜检,如有菌丝亦为感染。连续观察10d[2]。

1.2.8感染蚊虫酚氧化酶的测定:取贵阳腐霉转化株和野生株处理5d的蚊幼虫各20只,加入pH6.0的磷酸盐缓冲液1mL,冰上研磨。4°C、12000r/min多次离心,最终所得澄清液即为蚊虫粗酶液。酚氧化酶活性测定:取粗提液100μL,再加入0.01mol/L反应底物L-DOPA100μL。一个酶活单位定义为室温下每分钟每毫克总蛋白的A490改变0.001所需的酶量。考马斯亮蓝法测定蛋白含量,计算比酶活[13]。

1.3统计学处理

实验数据经SPSS11.5电脑统计软件分析处理。

2结果

2.1Pr1组成性表达载体pCambia-hph-Pr1的构建与酶切验证

按方法1.2.1扩增贵阳腐霉Pr1基因片段,获得大小约1100bp的片段,与预期片段大小一致。测序结果经BLAST比对与贵阳腐霉Pr1已知序列相同。按方法1.2.2构建了以潮霉素抗性基因hph为筛选标记,将目的基因Pr1置于真菌组成性启动子PgpdA之下,构建了表达载体pCambia-hph-Pr1(图1)。用BamHⅠ酶切pCambia-hph-Pr1进行验证,切下大小分别约为16.3kb和2.8kb的条带(图2),与载体酶切位点和预期片段大小相符。将该载体导入根癌农杆菌LBA4404菌株中,用于贵阳腐霉的遗传转化。

2.2贵阳腐霉转化株的获得及鉴定

按1.2.3方法,在选择培养基上培养23d,可见贵阳腐霉菌丝生长。随机挑取这些潮霉素抗性菌丝转接至新的含有200mg/L潮霉素B的选择培养基上时,正常生长的菌丝体初步确定为转化子。提取抗性菌株基因组DNA,以基因组DNA为模板,潮霉素抗性基因设计的引物进行PCR检测,电泳如图3显示,贵阳腐霉野生型菌株没有扩增到特异性条带,而抗性菌株均扩增到约780bp的目的条带。

2.3贵阳腐霉转化株的稳定性检测

将转化子在不含潮霉素B的KPYG2培养基上培养,连续转接10代,然后再接种到含有不同浓度潮霉素的培养基上培养,测量72h后菌落直径[14]。贵阳腐霉野生株生长随着潮霉素B浓度的增高受到抑制,当潮霉素B浓度达到150mg/L时,生长完全受到抑制。贵阳腐霉转化株的生长情况与潮霉素B浓度无相关性,与野生株在非选择培养基上的生长状况无明显差别(表1),表明转化子是可以稳定遗传的。

2.4转化株Pr1蛋白酶分析

在含蝉蜕的诱导培养基中,转化株的Pr1蛋白酶活性水平略高于野生株,但统计学分析无显著性差异。在含葡萄糖的基本盐培养基(非诱导培养基)中转化株产生的Pr1蛋白酶水平显著高于野生型菌株(表2)。2.5贵阳腐霉转化株菌丝游动孢子产量统计学分析表明野生株与转化株的游动孢子产量没有显著性差异(表3)。

2.6贵阳腐霉转化株灭蚊毒力检测

转化株的平均灭蚊效果比野生株灭蚊效果增强了近一倍,达到约33%,其中最高能达到约54.7%,两者比较差异有显著性意义。对蚊幼虫化蛹率的统计分析表明,转化株处理的幼虫化蛹率显著低于野生株和空白对照处理的幼虫(表4)。死亡蚊幼虫镜检观察,对照组死亡蚊幼虫尸体肿胀发白,表面无菌丝生长。野生株处理组死亡蚊幼虫尸体弯曲,94%尸体表面有菌丝体生长。转化株处理组死亡蚊幼虫尸体明显黑化,仅5.4%尸体表面可见菌丝体生长。

2.7贵阳腐霉转化株对蚊幼虫体酚氧化酶活性的影响

贵阳腐霉野生株和转化株处理的蚊幼虫,其酚氧化酶活性显著高于空白对照组,而转化株处理的蚊幼虫酚氧化酶活性数据高于野生株,但差异不显著(表5)。

3讨论

本实验中获得了遗传稳定的贵阳腐霉转化株,在非诱导培养基中产生Pr1蛋白酶活性显著高于野生株,说明转入的Pr1蛋白酶基因在非诱导的条件下能够组成性的表达。而在蝉蜕诱导培养基中,转化株的Pr1蛋白酶活性虽然在数据上要高于野生株,但统计学分析表明这种差异不显著。这与方卫国研究球孢白僵菌组成性表达类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1及几丁质酶基因Bbchit-1工程菌株的结果相似[15]。这有待于采用实时荧光定量PCR或者Western-Blotting等方法进一步验证,以检测在基本盐和诱导培养基的条件下,贵阳腐霉野生型菌株和转化株Pr1基因转录mRNA或表达Pr1蛋白酶水平的差异。游动孢子是贵阳腐霉产生的侵染蚊幼虫的单细胞结构,结果显示转入的Pr1基因并未影响贵阳腐霉的产孢能力和生长能力。

2007年贵阳腐霉野生型菌株对致倦库蚊幼虫的生物测定显示,其感染率为23.7%±13.0%[2],与最初分离时比较有显著降低。而目前,贵阳腐霉野生型菌株对致倦库蚊幼虫的感染率仅为16.7%±13.0%。在长期实验室人工传代培养的过程中,菌株毒力退化明显。因此我们期望采用菌株复壮、细胞工程和基因工程技术等技术以提高菌株的毒力。利用根癌农杆菌介导的Pr1基因在贵阳腐霉的遗传转化方法,获得的转化株处理的蚊幼虫死亡率明显提高。我们推测了以下几个原因:(1)在贵阳腐霉的野生型菌株,Pr1蛋白酶基因需要在昆虫体壁的诱导下才能表达,因此只有在游动孢子附着在昆虫体壁上时,分泌Pr1蛋白酶作用昆虫体壁局部。而转化株可组成性表达Pr1蛋白酶,在游动孢子附着前可能已表达Pr1蛋白酶,而游动孢子附着后也诱导Pr1蛋白酶的产生,使其更快速入侵并萌发生长,耗竭昆虫营养。(2)入侵后的转化株在昆虫血腔内仍然组成性表达Pr1蛋白酶,可能破坏寄主的正常生理活动,降低其免疫力。(3)St.Leger提出在感染昆虫晚期,当酚氧化酶水平明显降低的时候才在血淋巴中产生Pr1,显示出酚氧化酶具有抵抗Pr1的蛋白水解作用[6]。在转化株处理蚊幼虫过程中,产生了更多的酚氧化酶,以抑制超表达的Pr1蛋白酶的水解作用,同时,酚氧化酶水平升高也导致了其氧化后醌水平的升高,引起蚊幼虫醌中毒。

染病的蚊幼虫,取食量下降,生长速度明显减缓,最终死亡。转化株处理的蚊幼虫的酚氧化酶活性数值虽然高于野生株处理组,但是差异不显著,这与St.Leger的结果不一致。可能是由于St.Leger采用直接注射Pr1蛋白酶,且烟草天蛾幼虫体积大,易于获取足量的血淋巴用于检测,而蚊幼虫(孑孓)体积小,难以获得足够测试数量的血淋巴。因而我们采用孑孓的整体研磨液,得到的粗酶液里包含了血浆、血细胞、表皮和组织中的PO,因此检测的是总PO活性。这也可能是导致贵阳腐霉无论野生型抑或转化菌株对蚊幼虫的杀灭效率偏低的原因。