本文作者：乔莹、蔡鑫泽、赵连爽、陈冬、刘颖单位：中国医科大学附属第一医院中心实验室、沈阳军区第二零二医院综合内科

也称贝氏柯克斯体,是细胞内生短小杆菌(图1),其在酸性条件下代谢旺盛、在细胞浆的Endsome内繁殖,形成内封入体。C.b是Q热的病原菌,Q热是分布最广的人兽共患传染病之一[12]。由于Q热在临床上无特异症状和体征,因而与其他热性传染病难以鉴别,误诊率极高,应引起足够重视Q热分为急性Q热和慢性Q热。急性Q热多有报道,慢性Q热死亡率高难以治愈。鉴于Q热患者的临床表现多种多样,一般以发热、咳嗽、头痛、肌肉酸痛为主要症状,并常伴有肺炎、肝炎、心内膜炎、大动脉瘤等,与其他立克次体病的不同之处是无皮疹及外斐氏反应阴性。在缺乏实验室检查和流行病学资料分析往往未被重视的情况下,Q热的误诊和漏诊相当严重。世界范围内Q热的发病率呈上升趋势,感染途径不明的病例增多,有报道称与宠物增多呈正相关,我们从食品安全的角度,验证鸡蛋是否是潜在的Q热传染源之一[35]。

1材料与方法

1.1Coxiellaburnetii(C.b)菌PCR标准品及阳性对照CoxiellaburnetiigenomeDNA来源于NineMillII相菌,用引物OPM1:(5′-AGTAGAAGCATCCCAAGCATTG-3′)和OPM4:(5′-TTGGAAGTTATCACGCAGTTG-3′),进行PCR反应:95°C30s;95°C5s,55°C30s,72°C30s,共40个循环。应得到27kD外膜蛋白Com1基因的501bp的DN段。用胶DNA回收试剂盒(TaKaRa)回收501bpDN段后,测定DNA浓度,系列稀释作为标准品用于定量PCR反应。

1.2主要仪器PCR及巢式PCR反应使用ABIGeneAmpPCRsystem9700;定量PCR使用Corbett,测序仪使用ABI3130GeneticAnalyzer,荧光显微镜使用NIKON。

1.3试剂(1)PBST(g/L):NaCl8,Na2HPO42.89,KCl0.2,KH2PO40.2,Tween-201mL。(2)洗净液:10mmol/LTris缓冲液(pH7.2)含有0.5%NP-40,0.25%Tween-20。

1.4实验方法

1.4.1鸡卵总DNA提取方法:先取约1/9鸡卵黄,用40mLPBST稀释后、用2000r/min离心30min去沉淀,取上清再用10000r/min高速离心30min后取沉淀,沉淀用洗净液2mL洗净离心2次,将沉淀放入80°C冰箱冷冻20min,解冻反复操作3次后,用含有50mg/L蛋白消化酶K的裂解液(Promega,E397A)200μL,56°C2h消化处理后[6],用磁珠法提取DNA(TOYOBO,NPK-501)。

1.4.2定量PCR测定:引物OPM1(5′-AGTAGAAGCATCCCAAGCATTG-3′)和OPM3(5′-GAAGCGCAACAAGAAGAACAC-3′),应得到27kD外膜蛋白Com1基因的472bp的DN段。将上述鸡卵总DNA提取物的1/30(2μL),按照TaKaRaSYBRPremixExTaqTMII试剂盒说明书操作,PCR反应条件为:95°C30s;95°C5s,55°C30s,72°C30s,共40个循环。2%琼脂糖电泳后,确认产物为472bp的片段[7]。

1.4.3巢式PCR:引物OPM2(5′-TGCCTGCTAGCTGTAACGATTG-3′)和OPM3(5′-GAAGCGCAACAAGAAGAACAC-3′),应得到27kD外膜蛋白Com1基因的438bp的DN段。100μL体系含有:10×反应缓冲液10μL、2.5mmol/LdNTPs8μL、25mmol/LMgCl212μL、每种引物为80mmol/L0.8μL、Taq酶0.4μL,定量PCR反应产物2μL,用纯净水加到100μL。反应条件为:95°C5min;95°C30s,58°C30s,72°C90s,共30个循环。2%琼脂糖电泳后,确认产物438bp片段[8]。1.4.4PCR产物测序:用2%琼脂糖电泳后,切胶回收DN段,精制试剂盒精制PCRDN段产物,以OPM2为引物用直接测序法测定精制PCRDN段产物[9]。1.4.5鸡血球免疫荧光染色:用肝素抗凝抽取鸡血涂片并固定,用抗C.bCom1表面蛋白单克隆抗体稀释2000倍作为一抗染色37°C、2h洗净后,再用兔抗鼠荧光标识抗体稀释5000倍做为二抗染色后洗净,用光学及荧光显微镜照相。

2结果

2.1定量PCR加巢式PCR法测定C.b菌基因的感度用OPM1和OPM3作为C.b定量PCR反应引物,用C.b菌PCR标准品作为模板,标准曲线R2达到0.999。用OPM1和OPM3作为引物进行定量PCR反应,反应产物为472bp长度的DN段,可测出大约40个C.b基因片段;在定量PCR的基础上,用OPM2和OPM3进行巢式PCR反应,反应产物为438bp长度的DN段,可以在定量PCR的感度基础上增加10倍,可测出大约4个C.b基因。

2.2实际鸡卵的C.b菌DNA含量图2为实际从鸡卵中提取总DNA,进行定量PCR反应的部分电泳图。可见29、66、125、169、150、164号鸡卵为阳性,特异片段长度为472bp。定量PCR测定鸡卵可能保有的C.b菌量(表1),推算一个鸡卵黄中可能含有的C.b分子数,从104到106不等。它们中有2个PCR片段测序失败,其余6个片段测序皆为C.bCom1基因的一部分,其中150号基因有变异(表2)。

2.3鸡卵C.b菌DN段的测序及突变位点的确定用上游及下游引物同时测序定量PCR472bp片段,鸡卵黄DNACom1基因PCR产物测序结果中,与Ninemile菌株同部位基因相比的突变位点。表2中表示的突变位点是分别用上游引物与下游引物直接测序后,同时发生变异的位点,同时该位点没有其他可疑碱基峰出现。带下划线的碱基字母表示与Ninemile菌株同位点有变异;带下划线的氨基酸表示突变氨基酸。与Ninemile菌的Com1基因相比,有12个鸡卵C.bCom1基因有突变出现,其中8个引起氨基酸突变,4个突变为氨基酸静止性突变。有4个鸡卵呈现2个以上的突变位点,1个鸡卵中最多可测到4个突变位点,有2个氨基酸突变(表2)。

2.4鸡血涂片间接特异性抗体免疫荧光染色光学显微镜下可见鸡红血球为有核均匀椭圆形,白血球为不规整形有核;荧光显微镜下可见同一图像的白血球内有多数密集的荧光颗粒存在,确认为C.b内封入体(图3)。

3讨论

我们用定量PCR加上巢式PCR法可以使PCR反应感度增加10倍左右,用一般PCR反应产生501bp片段产物,通过胶回收法回收该片段,定量DNA浓度,以10倍系列稀释该DNA产物并作为模板,用上述定量PCR加巢式PCR法反应,定量PCR反应阶段可测出40个Com1基因[10],加上巢式PCR反应最多可测出4个Com1基因片段。理论上,如果C.b的整个基因只含有一个PCR特异性反应位点,并且整个基因做为底物与PCR产物做为底物的PCR反应差异可以忽略,那么用定量PCR加巢式PCR反应可以测出4个C.b菌的存在。实际上我们用上述定量PCR法,应用于鸡卵中,仅测出104左右的C.b菌。感度降低了数百倍,可能是由于鸡卵中提取的DNA杂质较多,并且卵黄中的高蛋白高卵磷脂可能是影响PCR反应的主要原因。用定量PCR反应测定鸡卵中的C.b菌Com1基因数量,在标准品的选用上,我们没能直接用C.b基因做为标准品,是由于C.b是细胞内菌,没有准确的定量方法,同时整体基因达2000kb左右,计数误差大,不准确。用501bpPCR反应产物为标准品,反应体系标准曲线R2高达99.99,曲线完美。我们用此方法推测一个鸡卵中的C.b菌基因数可达到106左右。我国也对C.b的检测做了大量的工作,亚红祥等[11]通过TaqMan实时定量PCR法对ISlllla基因检测可以检出10个基因数左右,并且他们用ISlllla基因片段(485bp)克隆质粒DNA模板作为标准品,相对于我们用PCR产物作为标准品来说,更具有说服力,为今后标准品的改进提供了方法学依据。我们分别测定了Com1基因的PCR反应产物的序列,发现有突变菌株。从Com1的97号到177号共80个氨基酸序列中,有8个鸡卵的C.bCom1基因发生变异,14个发生基因变异。我们选定变异菌株的条件是,一定用Forward及Reverse双侧引物分别测序并予以重复实验,在同一位点发生同一样变异的序列定为变异菌株,变异菌株也反证了鸡卵中C.b菌存在的真实性;我们也对C.b阳性鸡卵进行浓缩后,对免疫缺陷(SCID)鼠进行了动物实验,鼠脏器免疫组织化学染色结果表明为阳性(结果待发表),因此,我们确信本研究结果的真实性。为了佐证鸡可以感染C.b,我们捉取鸡身上的寄生虫、鸡螨虫等30个抽提DNA并进行PCR测定发现,C.bPCR阳性的占50%左右(结果未显示)。我们对鸡血涂片进行了大量的荧光染色测定,发现鸡白细胞中可以感染C.b菌,并能增殖。C.b菌在单核细胞或巨噬细胞内繁殖,鸡白细胞内确认到C.b菌证明C.b菌可以感染鸡,由于其寄生生物提取DNAC.bCom1基因PCR反应阳性,因此通过螨虫感染传播的可能性极大。以前有报道在鸡卵黄中可以分离到幽门螺菌,并证明有致病性,因此,我们推测鸡卵中的C.b菌也应该具有感染性。而最终能否从鸡卵中分离并培养出有生物活性的C.b菌是确定鸡卵是否是C.b菌感染源之一的唯一必要条件,鉴于C.b菌是细胞内菌,培养困难,还需要进一步的研究[1214]。