1材料与方法

1.1主要试剂及动物细胞培养液DMEM/F12及DMEM(高糖)、胎牛血清、重组表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维生长因子（bFGF-2）均购于GIBCO公司。含绿色荧光蛋白GFP的慢病毒载体表达质粒(pGC-FU)购于GENECHEM公司，pORF-hIL-12G2质粒购于InvivoGen公司，胰酶、DEPC、Tris碱、EDTA均购于Sigma公司，抗人CD133/PE抗体及抗人CD44/APC抗体购于BDPharmingen公司，BCA蛋白定量试剂盒购于ThermoFisherScientific，实验用6-8W龄雌性裸鼠由第三军医大学实验动物中心提供，由该中心负责饲养和管理。

1.2培养、分离、鉴定结肠癌CSCs结肠癌SW480细胞株购于ATCC，在干细胞条件培养基中（不含胎牛血清的DMEM/F12培养基，含20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF-2、1×B27和1%青链霉素）中筛选培养2周后，流式细胞仪分选出CD133+/CD44+SW480细胞作为结肠CSCs，分析其自我更新及分化。分选出的CSCs用干细胞培养基培养于37°C、5%CO2孵箱中，细胞增殖实验、克隆形成能力、成球能力及NOD/SCID体内成瘤能力鉴定其“干性”特征[8]。

1.3构建IL-12过表达慢病毒模型及转染CD133+/CD44+SW480细胞PCR扩增含IL-12p70基因片段的pORF-hIL-12G2质粒获得IL-12基因，通过酶切及连接构建重组IL-12/慢病毒质粒，取阳性克隆摇菌后行PCR鉴定，酶切鉴定及测序。鉴定正确的克隆摇菌扩大培养，用除内毒素大提试剂盒提取质粒DNA，293T细胞包装病毒，IL-12/慢病毒颗粒感染CD133+/CD44+SW480细胞，稳定转染的细胞称为“慢病毒/IL-12细胞”[8]。

1.4IL-12对结肠CSCs生物学特性的影响1.4.1IL-12对结肠CSCs分化的影响（SP免疫组化试剂盒检测CK20）为了观察IL-12对结肠CSCs的体外分化能力的影响，我们取转染IL-12过表达慢病毒质粒的细胞及未转染的CD133+/CD44+SW480在条件培养基中形成的克隆细胞球，移入含10%胎牛血清培养基中连续观察其生长情况，对两组细胞进行免疫组化染色，显微镜观察后照相。结果判断：被测细胞胞浆染色黄-棕色为阳性表达。

1.4.2IL-12对结肠CSCs克隆形成能力的影响将转染IL-12过表达慢病毒质粒及未转染的CD133+/CD44+SW480细胞计数后，调整细胞浓度。各取10000个两组细胞分别接种6孔板中，加入适量条件培养基，5％CO2，37°C培养。每隔1天半量换液1次。显微镜下观察细胞生长情况，7d后终止培养。

1.4.3IL-12对结肠CSCs侵袭性的影响实验分组：慢病毒/IL-12转染组；空载体转染组；未转染组（即空白对照）。使用前水化Matrigel基质胶，然后基质胶包被Transwell小室，置于37°C，5%CO2细胞培养箱中孵育。薯蓣皂甙元处理后24h接种细胞，1×104/ml细胞分别接种基质胶包被的小室，无血清培养基培养的细胞加入上层小室，含10%胎牛血清的完全培养基培养的细胞加入下层小室，将小室置于无菌24孔板中，加入250μl培养基。下室加入500μl培养基，5%CO2，37°C静置培养48h。取出小室，PBS轻轻淋洗，用棉头拭子小心移走膜上层的细胞，95%乙醇侵入到膜下层的细胞40min。PBS淋洗3次，苏木素染色。倒置显微镜（×200）下计数微孔膜下层的细胞，每孔随机选择5个视野，计数每个视野细胞数目，每个实验重复3次。14.4IL-12对结肠CSCs体内肿瘤形成能力的影响动物实验遵循第三军医大学临床学院伦理要求（批准号ID，SCXK（军队）2007015）。6-8周雌性NOD/SCID小鼠培养于无菌环境中，慢病毒感染后48h，NOD/SCID小鼠（n=15）皮下注射慢病毒/IL-12细胞5×103，或空载体转染的结肠CSCs5×103。接种后观察小鼠毛色、食欲、大小便等基本生命状况，30d后评估肿瘤形成。试验结束后切取肿瘤组织，称重并作相应检测，游标卡尺测肿瘤长短径，肿瘤体积=长×宽2。

1.5IL-12抑制CD133+CD44+SW480细胞生存机制研究

1.5.1Westernblot检测结肠CSCs转染前后STAT6、p-STAT6、survivin、IL-12和IL-4蛋白表达蛋白抽提试剂盒-II提取细胞上清液总蛋白，浓缩上清至原体积的1/30～1/10，蛋白样品按照1：4的比例加入5×上样缓冲溶液，100℃变性5min，分装。BCA法测蛋白浓度，酶标仪测定550nm处吸光度值。绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品浓度。SDS-PAGE垂直电泳，200mA恒定电流转膜80～90min。抗原-抗体反应及化学发光法显色，BIO-RAD凝胶成像分析系统扫描及图像分析，相对灰度值表示蛋白相对含量。

1.5.2IL-12对结肠CSCs凋亡的影响收集转染后各组细胞，PBS洗2次，1000r/min，离心5min，弃上清。用不含EDTA的消化液消化贴壁细胞。收集的各组细胞加入500μl结合缓冲液中重悬细胞，再加入适量AnnexinV-FITC和PI，同时设置阴性对照和补偿对照（分别单染），室温避光孵育20min。1000r/min，离心5min，弃上清，加入500μl结合缓冲液重悬细胞，流式细胞仪测定每个样本中凋亡细胞所占百分比，每个实验重复3次。肿瘤抑制率=对照组瘤重-治疗组瘤重/对照组瘤重×100%。1.6统计学方法计量资料数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，使用SPSS13.0软件进行统计。

2结果

2.1慢病毒-IL-12质粒构建及在CD133+/CD44+SW480细胞中表达前期结果证实慢病毒-IL-12表达质粒构建成功，慢病毒/IL-12细胞上清液高表达IL-12mRNA和蛋白[7]，为我们进一步探究IL-12体内作用及机制打下基础。

2.2结肠CSCs过表达IL-12对肿瘤球形成能力、侵袭性及分化的影响将CSCs悬浮于无血清的干细胞培养液中，肿瘤球形成后光学显微镜观察肿瘤球数量，结果显示IL-12降低了结肠CSCs肿瘤球形成能力，转染慢病毒-IL-12的CSCs不能形成明显的肿瘤球（图1A）。但使用IL-12抗体阻断后能恢复肿瘤球形成（图1B）。空载体转染的SW480CSCs形成的肿瘤球更大更紧密（图1C），但正常结肠细胞WM35不能形成肿瘤球（图1D）。另一方面，与对照组相比（图2B），IL-12增加CSCs分化标志CK20表达（图2A）。与SW480CSCs相比，慢病毒/IL-12转染CSCs的侵袭性降低40%(表1）。

2.3IL-12抑制NOD/SCID小鼠原发肿瘤生长研究发现慢病毒/IL-12减缓了CSCs肿瘤生长。慢病毒/IL-12转染的CSCs形成的肿瘤体积显著低于对照组[（189±21）vs（1785±32）mm3，P<0.05]，质量显著轻于对照组（P<0.01）。

2.4IL-12减缓结肠CSCs增殖，促使其凋亡IL-12转染也影响细胞凋亡及增殖。流式细胞分析显示，慢病毒/IL-12形成的肿瘤细胞周期发生改变，G1期细胞增加[（68.8±3.6）%vs（52.4±2.8%）]，而S期细胞降低[（22.6±2.8）%vs（38.6±4.1%）]（图5A），与对照组相比，凋亡细胞数量明显增加[(45.2±5.6%vs(4.1±1.2%)]（图6B）。

2.5结肠CSCs表达IL-4和STAT6,IL-12抑制IL-4/STAT6信号途径Westernblot结果显示，CSCs表达IL-4升高，表明CSCs内存在IL-4自分泌信号。值得注意的是，CSCs内STAT6被激活。慢病毒/IL-12降低IL-4/STAT6及survivin产生（图4）。

3讨论

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，随着人们生活水平提高，饮食结构改变，其发病率有增加趋势，尤其在发达国家及发展中国家。直至目前，结肠癌主要的治疗手段仍是手术切除，且手术较其他治疗效果更佳，尤其是早期肿瘤，但肿瘤转移及复发仍是晚期患者治疗失败的主要原因。最近研究表明，CSCs能够始发免疫缺陷小鼠肿瘤生长[1-2]，并与肿瘤转移及复发相关。从理论上讲，靶向CSCs治疗能够彻底消除肿瘤复发及转移，因此靶向CSCs的肿瘤治疗策略将比目前的传统治疗方法更有效的根治肿瘤，减少复发和转移的发生率，为肿瘤的靶向诊治提供了新靶标，为根治肿瘤带来了新希望[14]。免疫抑制仍是多数预期较好的肿瘤治疗手段的主要障碍，而细胞因子失衡是机体免疫功能紊乱的主要原因，并导致肿瘤进展及复发[15]。关于细胞因子的抗瘤免疫反应相关研究包括IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12等，已有研究表明，IL-12能有效地增多种肿瘤的抗瘤免疫反应，但IL-12对CSCs生存及侵袭性的作用并不清楚。本研究报道IL-12低水平表达/不表达与结肠癌进展的相关性，证实IL-12对直接限制CSCs恶性表型的潜在益处。本研究中，我们成功构建含IL-12cDNA的重组慢病毒质粒，用包装病毒的工具细胞293T细胞包装纯化后，获得较高滴度的病毒颗粒，将其转染CD133+/CD44+SW480细胞，慢病毒/IL-12细胞高表达IL-12mRNA及蛋白，说明稳定转染IL-12的结肠CSCs系建立，同时也证明慢病毒作为基因研究的载体具有低毒、高效的优势。结果表明，IL-12损害干性维持部分是因为抑制CSCs增殖；而且，IL-12降低分化标志CK20表达，证实IL-12介导促进分化的信号通路；与SW480细胞相比，慢病毒/IL-12细胞的侵袭性降低了约40%，表明IL-12显著抑制CSCs侵袭性。

本研究发现，与转染空载体的CD133+/CD44+SW480细胞相比，慢病毒/IL-12降低CSCs肿瘤形成，慢病毒/IL-12皮下注射明显减少肿瘤体积及重量，抑制肿瘤微血管形成，促进肿瘤局部缺血坏死，与对照组相比，IL-12转染组的肿瘤增殖细胞减少，而凋亡细胞增加，这些发现证实慢病毒/IL-12能够降低结肠癌移植瘤生长，也许对结肠癌患者有益。IL-12促进CSCs凋亡，降低细胞自我更新及结肠癌移植瘤生长的机制并不清楚，最近研究表明“干细胞”自分泌IL-4，抵抗细胞凋亡，我们研究证实，CSCs高表达IL-4和p-Stat6。综上所述，结果表明结肠CSCs中存在IL-4和p-Stat6信号通路，与对照组相比，IL-12使结肠CSCs分泌IL-4蛋白降低60%，而且，IL-12影响CSCs凋亡及增殖。尽管我们的数据支持IL-12水平和CSCs及肿瘤生长之间的逆反关系，与对照组相比，IL-12明显降低结肠CSCs分泌IL-4和p-Stat6蛋白，其潜在机制仍需进一步研究。

作者：尹晓玲陈应果张建红周先云陈华俊赵银晶梁后杰单位：重钢总医院肿瘤科重钢总医院普外科重钢总医院病理科