生甘草范文第1篇

有些人，他们也像甘草一样生活着，那么坚定，那么低调，那么无怨无悔……

她本应该是个不平凡的女子，年轻，漂亮，有着自己的音乐梦想，但她甘愿做一个平凡的妻子，照顾孩子，默默地支持丈夫向他的梦想前进，她就是科雷塔――为黑人解放事业奋斗到最后一刻的黑人领袖――马丁・路德・金的妻子。

在金为事业奋斗而顾不上家庭时，她默默的抚养着三个孩子，同时还要忍受贫穷，还要忍受仇恨黑人运动者的威胁和伤害。她默默地支撑着这个并不安稳的家庭，默默地做金的最坚实的后盾，不图名利，虽然她一直生活在金的光环之外，但她无怨无悔。

他，高大英俊，年轻的他是一个哲学系的大学生，风华正茂，却爱上了一个年过花甲的老人，他便是雅恩，他的情人就是著名的作家杜拉斯。

杜拉斯创作过许多作品，获奖无数，她的小说《情人》享誉世界，是她的才华和热情，深深的打动了雅恩，使他甘愿放弃自己的工作来做她的“清洁工”“打字员”“护士”……他无微不至的呵护了她整整十五年，一直到她去世。尽管杜拉斯的时时粗暴任性，致使他们时常争吵不休，尽管他们的感情引起了世俗的偏见，外界给予他们的压力很大。

他从没有想过要从杜拉斯身上获取半点名利，他只是一直在她的光环之下，无怨无悔的照顾她，为她的晚年增添了无数的快乐，在他遵照她的遗嘱写了《我的情人杜拉斯》一书来记住他们的爱情而引起无数人的关注时，他放弃了这唾手可及的名利，从此隐姓埋名，让他们的爱情保持完美。

他们的快乐，就像甘草，苦中的甜是最难忘的。他们就如甘草，即使被别人的光环所埋没也无怨，哪怕是放弃了自己的梦想也无悔，尽管活得艰辛仍对自己的所爱不离不弃。

生甘草范文第2篇

由于亚磷酸二甲酯合成法生产草甘膦的废水中含有一些比较容易生化的物质，例如甲醇等，可以采用生化处理的方法。在我国很多该种工艺中，基本上都在采用生化处理的方法，但是需要注意的问题是，使用该种方法处理过的废水，磷含量依然保持在较高水平。在IDA工艺法的双甘膦废水中，其往往含有浓度较高的有机膦化合物，这种化合物往往具有较高的生物毒性，且含有的2%一4%甲醛成为生物抑制剂；中间体二乙醇胺及其衍生物属不易生物降解类物质等。可以看出，废水中的这些物质不仅很难进行生物降解，而且对水质还具有很大影响，成为让许多企业头疼的问题。

2草甘膦生产废水处理技术

对草甘膦的生产分析发现，其利用的原料主要有亚氨基二乙睛、盐酸、氢氧化钠、三氯化磷、重金属催化剂、硫酸亚铁、二乙醇胺等，其排出的废水更是含有甲醛、盐酸、双甘酸、氯离子草甘磷生产废水处理靳淳刘伟(浙江省天正设计工程有限公司，浙江杭州310000)摘要：草甘膦在我国还有几种叫法，分别为镇草宁、农达、草干膦、膦甘酸，属于氨基甲撑膦类含有羧酸基的化合物。采用当前工艺生产出来的草甘膦产生的废水中往往含有各种有机物质，因此，使得废水往往具有浓度高、对环境污染比较严重的特点。因此，本文首先结合当前两种主要的生产草甘膦工艺所产生的废水进行了研究，在此基础上对有效处理该种废水的方法进行了分析。关键词：草甘膦；生产废水；处理和亚磷酸等成分。明显可以看出，排出的废水含有较高的磷和氯离子，废水呈酸性，pH值的数值接近于1。因此，草甘膦生产的废水几乎呈现饱和盐的状态，具有高毒性、高浓度性，有许多事不可生物降解物或对生物抑制物，这些都使得对其治理便的困难重重。草甘膦的废水不仅可以给环境带来很大的危害，而且也造成了严重的资源浪费，这些都和其中的草甘膦及催化剂无法回收有很大关系。因此，下文将对草甘膦生产废水的有效处理技术进行探讨：

(1)亚磷酸二甲酯工艺草甘膦废水处理技术

甲醇塔废水的可生化性取决于塔效和操作情况，塔效及操作的好，则废水COD低，生化性较差。由于废水中含有机膦，总磷严重超标，为了提高可生化性、降低总磷，应对甲醇塔废水进行一级处理。高浓度废水一级处理后具有可生化性，可与低浓度废水混合(称综合废水)进行生化处理，生化装置同时考虑脱氮除磷问题。

(2)双甘膦废水处理技术

笔者通过试验并对多种处理技术进行分析后得知，采用以下工艺最为有效：高浓度废水二级沉降收集悬浮状的双甘膦；催化水解，使双甘磷分解成无机磷并使之沉淀，同时去除废水中的甲醛；A/O生化工艺处理综合废水。采用该技术治理后，废水中各项有关污染物指标可以达到综合污水排放标准(GB8978-96)。具体来说，先采用清污分流的方法，双甘膦废水单独收集入高浓度废水储池。因废水中含有悬浮的双甘膦产品，收集过程需二级沉降回收产品。低浓度废水进入低浓度储池。为便于预处理及对生产工艺的控制考核，高浓度废水在发生源处收集，预处理装置放在生产车间处。然后进行催化水解预处理，预处理后的废水便具有了生化的可行性，生化处理红COD的去除率便可以达到接近百分之八十，而且可以取得的一定的经济效果。

3结语

生甘草范文第3篇

[关键词] 老年；缺血性中风；厚朴生姜半夏甘草人参汤；莫利；胃肠功能

[中图分类号] R259 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）14-0131-05

[Abstract] Objective To investigate the clinical effects of adding or decreasing Houpo Shengjiang Banxia Gancao Renshen soup on the improvement of gastrointestinal motility of patients with senile ischemic stroke accompanied by gastrointestinal symptoms. Methods 47 patients with senile ischemic stroke accompanied with gastrointestinal symptoms who were admitted in our hospital were selected and analyzed， and they were randomly divided into treatment group and control group. Patients in treatment group were given Houpo Shengjiang Banxia Gancao Renshen soup， which were taken orally， while patients of control group were given mosapride. The course of both groups was 20 days. The clinical treatment effects of patients from both groups were compared. Results The total effective rate of treatment group was 88.46%， while the total effective rate of control group was 52.38%. The grades of symptoms and vital signs of patients from both groups after the treatment were all lower than those before the treatment. After the treatment， the grades of symptoms and vital signs of patients from treatment group were lower than those of the patients from control group and statistical significance was presented in the intergroup comparisons（P

[Key words] Senile； Ischemic stroke； Houpo Shengjiang Banxia Gancao Renshen soup； Mosapride； Gastrointestinal function

中风为常见的急性脑血管疾病，中风可分为缺血性脑中风（脑血栓形成、脑梗死）和出血性脑中风（脑出血、蛛网膜下腔出血） ，以老年患者居多[1]。有研究指出脑卒中患者无论在急性期还是恢复期均易发生便秘，发生率高达50%以上[2]。大部分老年缺血性中风患者，特别是偏瘫卧床患者均存在不同程度的胃肠功能下降，蠕动减慢，容易引起腹胀、便秘、反流、窒息、肠内营养摄入不足而影响康复，甚至危及生命[3]。

临床在处理老年缺血性中风患者腹胀、便秘等情况时，不乏用大黄、芒硝等峻下之品或入煎剂，或敷脐，或灌肠；或多用莱菔子、神曲、麦芽、鸡内金等消导之物；治疗时重用峻下者伤脾胃，重用消导之物则耗气。老年缺血性中风患者在体质的辩证上虚实夹杂，天癸竭，脾肾等各脏已虚，又多有瘀血痰浊先阻于经络，在用药的选择上需兼顾虚实，厚朴生姜半夏甘草人参汤方属消补兼治之方，本研究选用该方调节老年缺血性中风患者胃肠功能，观察疗效并报道如下。

治疗上，西药多选用多潘立酮片、莫沙必利片等胃肠动力药物，或双歧杆菌三联活菌胶囊、酪酸梭菌活菌片等调节肠道菌群药物，或二甲硅油片等消除肠胀气等药物。中成药有四磨汤、午时茶颗粒、厚朴排气合剂、苁蓉通便液、理中丸等等。用中药汤剂治疗时，选方则见仁见智。如邓秋分[9]用新加黄龙麻仁汤治疗老年中风后便秘。苟成钢[10]用星蒌承气汤加中药敷神阙穴，结合温针灸治疗脑卒中后便秘。郑桂棒[11]用增液承气汤治疗卒中后腹胀便秘。

关于腹胀的中医论述，郝万山在伤寒讲稿里是这么描述的：“腹胀者，分虚、分实或虚实夹杂。一是虚胀：特征为腹满时减、喜温喜按，得温得按则减轻，治用理中汤类温中散寒。二是实胀：特征为“腹满不减，减不足言”，“按之痛”，治用承气汤类通泻里实。三是厚朴生姜半夏甘草人参汤证证属虚中夹实，腹胀满一般多表现为上午轻，下午重，傍晚尤重，但胀满发作的时候不喜温按。在病机上以脾气虚弱为本，痰湿阻滞、气机不利为标，属虚实夹杂。”老年缺血性中风患者的腹胀便秘进食量下降等症状从病机上讲多为虚实夹杂[12]。在诊疗过程中选择一个适合该类人群使用的方子对提高临床疗效、改善患者的生活质量尤为重要。

3.2 厚朴生姜半夏人参汤方属消补兼施之方

厚朴生姜半夏甘草人参汤方出自《伤寒论》太阳病篇，条文见第六十六条，条文如下：“发汗后，腹胀满者，厚朴生姜半夏甘草人参汤主之。”该方由厚朴、生姜、半夏、甘草、人参组成，病机是脾气虚弱，运化失健，气机阻滞。“发汗后，表邪虽解而腹胀满者，汗多伤阳，气滞不行也，是不可以徒补，补之则气愈窒，亦不可以径攻，攻之则阳益伤”[13]。故治疗上消补兼施、补泄并行，脾气恢复，运行功能正常，则腹胀满可消。发汗后说明病人有虚，一有体虚的存在，二是提示致虚之由。故泄后、吐后、术后、产后等虚性体质，都有应用本方的机会[14]。

该方原方剂量：厚朴半斤，生姜半斤，半夏半斤，甘草二两，人参一两。厚朴、生姜、半夏这三者量大，行气消补，以厚朴为君，微苦性温，行气燥湿，宽中消满，善于下气，除胃中滞气。臣以生姜，半夏，生姜味辛温，宣散通阳，行胃中之滞气；半夏辛温，开结豁痰，降胃中逆气；两者与厚朴为伍，辛开苦降，温阳行气，使泄满消胀之力更强；因所治胀满乃脾虚气滞而成，故消中加补，佐以甘平之甘草补气健脾，并调和诸药。然甘草补中之力不足，用少量人参增强其作用。

厚朴生姜半夏甘草人参汤方，方证见：腹胀满，心下痞硬，食欲不振，腹胀以饭后为甚，或呕吐，精神疲惫，肢软无力，苔薄白，脉缓。本方证所见实证腹胀满，是以有形痰湿阻结，气机壅滞为主；虚证表现为便溏、神疲，还有食后腹胀、欲寐、矢气频频但无臭味、肠鸣频作、大便成形，但次数多或排便不畅、平时食凉物易便溏或便意感强等。

古代医家对该方的认识如下。成无己：“发汗后，外以解也。腹胀满知非里实，由脾胃津液不足，气涩不通，壅而为满，与此汤和脾胃而降气”[15]。周凤歧：“遇脾虚作胀者，辄借用之，而脾虚夹积，泄泻不节，投之犹有特效”。《伤寒尚论篇》：“移此治泄后腹胀，果验。”《张氏医通》：“治胃虚呕逆，痞满不食”。清代医家缪遵义论述本方：“立方大意，泄胀满之心，偏多于辅正，方中叙药之次第，即可见也。首用厚朴，苦温以泄中焦之胀满，阳微则饮聚，此用生姜、半夏，辛通开泄，浊阴自散，三味用至半斤，重其权也，继用甘草二两、人参一两，以稍助其止气，是意不在补，不过为厚朴之佐使耳”（《伤寒方集注》）[16]。

现代医家拓宽了该方的治疗范围及病种。日本医家山田光胤将本方的应用概括为：①用于胃的蠕动和胃液分泌极度低下、腹中气与水停滞、心下腹部胀痛，饮食即吐，大便不通之证。②用于发汗、下利、中风、腹部手术之后容易引起的胃下垂、胃扩张、肠胀气、急性胃肠炎、急性吐泻等。③本方可转用于脑溢血或胃切除术后的食物在消化道通行障碍等。（《汉方处方应用的实际》）。日本医家藤平健次先生将厚朴生姜半夏甘草人参汤应用腹虚肠满者、呕逆痞满不食者、伴嗳气吞酸诸症、胃（肠）下垂症、臌胀症、肠梗阻、伴吐泻的感冒、腹部手术后的排便不畅、中风后的腹满等[17]。黄煌在经方100首里提示该方可广泛应用于泄后、吐后、术后、产后等虚性体质。推广到现代临床，妇女产后、患者胃肠道手术后、脑梗死以及急性感染治疗后腹胀纳差的患者都属于该方的可能应用范围。常钢[18]将该方用于治疗胃炎、胃肠神经官能症、胆囊炎等以脾虚气滞为主的疾病；郭宏强等[19]将该方加减治疗肝癌患者尤其介入术后的腹胀。曹生有[20]将该方加减治疗便秘、胆囊炎、前列腺炎；田健[21]将该方联合奥曲肽注射液治疗不完全性肠梗阻。王彦军[22]用该方加味治疗腹部手术后腹胀。程涛[23]将该方用于治疗肝癌晚期腹胀。

3.3 与他方的鉴别

在临床上用该方需与他方鉴别。他方或用于实证，或用于虚证，亦有用于虚实夹杂之证，在治疗时应进行充分的证的观察。

生甘草范文第4篇

关键词：甘草；内生菌；甘草酸

中图分类号：Q949．32文献标识码：A文章编号：0439－8114（2011）14－2841-03

Isolation of an Glycyrrhizic Acid-producing Andophytic Fungus from Licorice and Analysis of Metabolites

WANG Hong－xia，LI Ya－li

（School of Mathematics， Physics and Biological Engineering， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014010， Inner Mongolia， China）

Abstract： A strain of glycyrrhizic acid－producing endophytic fungi was obtained from the rats of licorice in Erdos city of the Inner Mongolia autonomous region by tissue culture method．Then the purified endophytic fungal strains were fermented． The glycyrrhizic acid in the fungal extract was extract and confirmed by HPLC and LC－MS by comparison with glycyrrhizic acid standard． The strain B12 that was found as the glycyrrhizic acid-producing andophytic fungus was grouped into Fusarium based on the morphological traits．

Key words： licorice； endophytic fungi； glycyrrhizic acid

内生真菌（Endophytic fungus）是指生活在健康植物组织内部，但不引起植物病害的真菌。不仅能够参与植物次生代谢产物的合成和转化，还能独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物的重要来源和具有高度开发价值的新型生物资源。自从1993年Stierle等［1］首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种产紫杉醇的内生真菌以来，许多研究者在多种植物中分离到了能产生与宿主相同或相似生理活性代谢产物的内生菌。迄今为止，已从夹竹桃科、小檗科、杜仲科、禾本科、红豆杉科等多年生药用植物内生真菌中分离到多种活性物质［2］。甘草（Glycyrrhiza inflata Bat．）为豆科（Leguminosae）多年生草本植物，以干燥的根及根状茎入药。主要有效成分甘草酸（Glycyrrhizic acid）为五环三萜皂甙化合物，不仅具有增甜、增香和增加风味的作用，而且还具有抗炎、抗变态反应、抗病毒包括抗肝炎病毒、抗艾滋病（AIDS）病毒和抗单纯疱疹病毒等作用，被广泛应用于食品和药品等领域。由于甘草酸结构复杂，无法人工合成，甘草酸的获得只能从甘草根中提取，而野生甘草资源已近枯竭，人工种植周期过长、组织培养技术目前实现甘草酸的工业化生产还比较困难，因此筛选和利用内生菌来生产甘草酸有可能是一种全新的选择［3］。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1甘草样品在内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗梁外甘草标准化示范区采集甘草完整植株，随机选取根部装入灭菌纸袋内编号备用。

1．1．2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200．0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 1．0 g，MgSO4・7H2O 0．5 g，琼脂15．0～20．0 g，加水定容到

1 000 mL，121 ℃灭菌30 min，去琼脂为液体培养基。查氏培养基：NaNO3 2．00 g，K2HPO4 1．00 g，KCl 0．50 g，MgSO4・7H2O 0．50 g，FeSO4・7H2O 0．01 g，蔗糖30．00 g， 琼脂15．0～20．0 g，加水定容至1 000 mL，1×105 Pa灭菌30 min。

1．1．3主要试剂和仪器甘草酸标准品购自阿拉丁试剂（中国）有限公司，纯度＞99．0％（HPLC）；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，均购自国药集团上海化学试剂厂。高速冷冻离心机TGL－16G（上海安亭科学仪器厂），低速台式离心机TDL－5A（上海安亭科学仪器厂），Agilent－1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。

1．2方法

1．2．1甘草样品预处理用无菌水洗净甘草的根表面，无菌刀剥去外皮，取内皮和韧皮部，同时剪成0．5 cm×0．5 cm的小块，用75％乙醇浸泡5～10 min表面消毒，然后用无菌水冲洗5min去除表面消毒剂，再用0．525％ NaOCl浸泡7 min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分［4］。

1．2．2内生真菌的分离和纯化经过预处理的材料接种于PDA固体培养基上，25 ℃培养，待菌落长出后，挑取不同形态菌丝，接种于新鲜PDA培养基上，培养3～5 d后，再挑取菌丝分离单个菌落，如此反复纯化多次，得到纯化菌株［5］。

1．2．3内生真菌形态观察将纯化培养物接种到查氏培养基上，28 °C下倒置培养，待刚长出菌丝时，将无菌的盖玻片斜插入平板内（插片法），继续培养至菌丝爬满盖玻片，将玻片取出，在显微镜下观察其特征。根据形态学特征，包括菌落的生长速度、菌丝体以及孢子的特征、分泌色素等，参照丝状真菌的分类鉴定方法将上述真菌菌株鉴定到适当的属［5］。

1．2．4内生菌发酵培养将分离纯化的菌株接入250 mL三角瓶中（含PDA液体培养基50 mL），25 ℃、150 r／min发酵培养7 d。

1．2．5发酵产物的提取发酵结束后真空抽滤，分别收集滤液和菌丝体。滤液用等体积的二氯甲烷萃取3次，合并上层有机相；菌丝体冻融后充分研磨，加入30 mL乙酸乙酯，超声萃取15 min，有机相与前述有机相合并，于旋转蒸发仪上35℃去除有机溶剂，得到的萃取物溶于1 mL甲醇中，供检测用［6］。

1．2．6HPLC检测色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB－C18；流动相为甲醇－0．2 mol／L 醋酸铵溶液－冰醋酸（67∶33∶1）；流速为1．0 mL／min；检测波长为251nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

精密称取甘草酸标准品2 mg，甲醇定容至10 mL，得母液浓度为0．2 mg／mL，将母液依次稀释成浓度梯度为0．10、0．08、0．04、0．02和0．01 mg／mL，取10 μL进样（n＝5），得回归方程为＝5．061 4x－45．678 0，r2＝0．998 5。建立标准曲线，将标准品和样品分别进行HPLC分析［7－9］。

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1．2．7LC－MS检测液质联用仪条件：以甲醇∶水＝70∶30为流动相，流速0．3 mL／min，紫外检测波长251 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。电离源：电喷雾电离源（ESI），毛细管电压为3kV，锥孔电压为20 V，源温为100 ℃，脱溶剂气温度为300 ℃，扫描范围为90～800D。

2结果与分析

2．1菌种分离

从甘草根部共获得了36株单一的丝状真菌。其主要分离部位为韧皮部，因植物材料表面严格消毒并整个过程在超净工作台中进行无菌操作，故上述纯化菌株均可确认为是甘草的内生真菌。

2．2HPLC检测结果

HPLC分析结果（图1）表明，标准甘草酸的保留时间为5．185 min，而与之相似的是菌株B12发酵纯化产物的保留时间为5．207 min。由此可以初步判断菌株B12发酵纯化产物与标准甘草酸峰为同一物质。

2．3LC－MS分析

在液质联用分析中，甘草酸标准品产生一个m／z为821．5的离子峰和一个m／z为843．5的离子峰（图2），菌株B12发酵纯化产物也产生一个m／z为821．5的离子峰和一个m／z为843．5的离子峰。结果表明，甘草酸标准品和发酵纯化产物的LC-MS图谱基本一致，其中821．5和843．5处的两离子峰是甘草酸分子的［M-H］-和［M－H＋Na］-，因而可以说明菌株B12发酵纯化产物中含有甘草酸。

2．4甘草酸的含量测定结果

精密称取甘草酸标准品1 mg，甲醇定容至10 mL，得母液浓度为0．1 mg／mL，取配置好的甘草酸标准品溶液以无水甲醇稀释，分别配制成10、50、100、200、1 000 μg／mL的标准品溶液，摇匀，得系列浓度对照品标准溶液。分别精取上述对照品溶液各10 μL在设定好的色谱条件下在高效液相色谱下进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，相应的浓度为横坐标，得标准曲线方程为＝5．061 4x－45．678 0，r2＝0．998 5，将样品进样所得峰面积代入方程得甘草酸产量为346．1 μg／L。

2．5内生真菌形态特征及分类

从已分离纯化的菌株中获得4株可以产甘草酸的内生真菌，其中编号为B12的菌株在查氏培养基上生长较快，28 °C培养7 d，初期为短绒状菌丝，逐渐向培养皿四周生长，后期菌落中央颜色变深，深色部分为分生孢子团，白色部分即分生孢子团边缘围绕的无色菌丝（图3）。菌丝呈棉絮状至绒毛状，最初白色，后期逐渐变灰黑，培养基反面暗色；菌丝有隔、分枝、透明，直径1．5～3．5 μm。根据该菌株的形态学特征，查阅相关文献与镰孢霉属（Fusarium）的分类特征基本一致，菌株B12暂定为镰孢霉属。

3小结与讨论

在长期的共生环境中，内生真菌和宿主植物相互作用，建立了平衡关系，在植物体内形成相对稳定的真菌菌群，为此很可能获得了相关基因的直接传递，能产生与宿主相同的成分。药用植物中的内生真菌具有丰富的多样性，可以产生与宿主相同的在医药、农业、工业等行业有重要应用价值的活性物质。利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，满足人们日益增长的需求；同时有利于珍稀、濒危药用植物资源的保护，减少野生药用植物多样性的破坏。

研究从内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗采得的甘草中分离得到一株产甘草酸内生真菌，经过形态学特征研究分析，初步鉴定该菌株为镰孢霉属。通过HPLC、LC－MS分别对菌株B12发酵产物进行分析检测，确定其产甘草酸，产量为346．1 μg／L，和已报道的甘草酸生产真菌相比，该菌株产量较高。目前已报道的内生真菌的发酵产量均比较低，通过分离筛选高产量的菌株，优化发酵条件，对菌株进行诱变育种等方式有望提高产量。该菌株在PDA液体培养基中生长较快、产率稳定，有利于通过驯化、诱变育种及优化发酵条件来提高甘草酸的含量，以达到工业化生产的要求。

参考文献：

［1］ STIERLE E A， STROBEL G， STIERL E D， et al． Taxol and taxaneproduction by Taxomyces andreanae， an endophytic fungus of Pacific yew［J］． Science，1993，260：214-216．

［2］ 饶小莉． 甘草有益微生物的分离、鉴定及共接种效果初探［D］． 北京：中国农业科学院，2007．

［3］ 宋素琴，欧提库尔，张志东，等． 新疆胀果甘草内生菌的分离和鉴定［J］． 微生物学通报，2007，34（5）：867-870．

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［6］ 田仁鹏，杨桥，周国玲，等． 一株产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌的分离及分类研究［J］． 武汉植物学研究，2006，24（6）：541-545．

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［8］ 耿直，刘开辉，赵鑫，等．一株产紫杉醇中国红豆杉内生真菌的分离和鉴定［J］． 微生物学通报，2010，37（2）：199-203．

［9］ 孙春燕，何思煌． 一种产紫杉醇内生菌的发酵研究［J］． 成都大学学报（自然科学版），2007，26（3）：195－197．

生甘草范文第5篇

[关键词]甘草；愈伤组织；药用次生代谢产物；HPLC；指纹图谱；差异度

甘草是世界上最古老也是最常用草本药材之一，大量使用和长期过度开发使得世界上的野生甘草资源面临枯竭的危机。甘草植物细胞和组织培养是生产药用材料尤其是其活性成分的一种有意义的技术。但是到目前为止，所有有关甘草细胞诱导和培养的研究报道只关注愈伤组织诱导条件对细胞中某类特定的次生代谢产物合成的影响[1-5]，未见关于不同诱导条件对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性影响的报道。尽管诱导培养获得的细胞与野生或人工种植的甘草药材含有相似的活性次生代谢产物，但是如果它们的次生代谢产物有显著差异，它们的药用价值是不相同的。同时，作为一个培养生产中药植物药用成分或组分的技术，合适的细胞株系建立和选择与其次生代谢产物多样性密切相关。因此，本实验旨在利用一种简单快速的方法来评价不同诱导培养条件对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性的影响，具体来说是结合对愈伤组织的总黄酮化学分析和HPLC指纹图谱分析来定性定量评估不同诱导培养条件下甘草愈伤组织的次生代谢产物多样性的差异以及甘草愈伤组织与道地种植的甘草药材的差异，从而为高产药用次生代谢产物以及植物细胞作为替代药材的甘草细胞株系的筛选提供实验依据。

1材料与方法

1.1样品 甘草种子和三年生甘草根均购自新疆神农有限公司，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.，GI）和光果甘草（G. glabra L.，GG）；乙腈（NO.100269，SK Chemicals，Korea）和冰乙酸（天津光复精细化工研究所）均为色谱级；实验中所用到的其他的化学品除有特别说明外，均为分析级药品。

1.2种子萌发 挑选充实饱满的胀果甘草和光果甘草种子，用玻璃砂研磨去除表面蜡质种皮，自来水冲洗7～10遍，用75%的乙醇消毒20 s后，用无菌水冲洗5～7遍，接着用3.68 mmol・L-1HgCl2溶液消毒7～8 min，再用无菌水冲洗7～10遍，用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种到MS0（不添加激素）琼脂培养基上[6]，置于黑暗条件下，25 ℃培养。3 d后，种子萌发出新鲜的嫩芽。

1.3愈伤组织诱导和继代 胚轴和子叶是文献中最常用的甘草愈伤组织诱导的2种外植体，成功率较高[1-2，7]。本研究选择这2种外植体进行研究，将萌发11 d后的无菌苗胚轴切成约0.5 cm的小段，子叶切成约0.5 cm2的小块接种到诱导培养基上（MS基本培养基+激素+质量分数为3%的蔗糖+质量分数为0.7%的琼脂），pH 5.8。根据文献选择的其他典型的愈伤组织诱导的激素组成和光照条件见表1[2，5，8]。25 ℃培养，8 d后，进行第1次继代，继代的愈伤组织的培养条件和培养基组成与愈伤组织诱导相同，继代周期为21 d[9]。

1.4愈伤组织分析样品的制备 不同诱导条件下获得的甘草愈伤组织连续继代4次，生长稳定后，取培养1个周期的愈伤组织，45 ℃干燥至恒重，然后将愈伤组织研磨成粉末，取0.2 g甘草愈伤组织粉末加入10 mL 70%乙醇，室温下放置24 h，超声提取30 min，放冷至室温，补足溶液到刻度，取上清过0.45 μm滤膜备用。

1.5总黄酮含量的测定 准确量取2 mL样品溶液，加入0.5 mL质量分数为10%KOH，涡旋混匀，室温下放置5 min，加 70%乙醇到10 mL，涡旋混匀，室温下放置90 min，以 70%乙醇为空白对照，在400 nm波长下测定样品吸光度，以甘草苷为对照品绘制标准曲线。

1.6HPLC色谱分析条件 Agilent 1100高效液相色谱仪（配有G1314A紫外检测器、G1311四元梯度泵、G1379A在线脱气装置、G1329B自动进样器），Agilent 1100化学工作站；色谱柱为Apollo C18柱（4.6 mm×250 mm，粒径5 μm）。检测波长254 nm；流速为1 mL・min-1；检测温度为25 ℃；进样量20 μL，流动相A乙腈，B 1%醋酸溶液，流动相梯度为0 min，90% B；15 min， 80% B；35 min， 70% B；45 min，50% B；50 min，40% B；55～65 min，30% B；70 min，50% B；75 min，70% B；80 min，90% B。

1.7数据分析 本实验中的所有数据都是采用至少3个重复，以±s表示。采用单因素方差法（One-Way ANOVA）分析不同诱导培养条件对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响。采用中药指纹图谱相似度评价系统（2004，A版）分析愈伤组织次生代谢产物的多样性的差异。

2结果与讨论

2.1不同诱导培养条件对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响 为考察不同诱导培养条件对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响，分别选取了一些典型的诱导条件包括甘草种属、外植体、光照条件和激素组合进行了5组试验，见表1。其中，处理组A和B，C和D，A和C，D和E分别考察2种甘草种属、光和暗条件、2种外植体、2种激素组合对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响，结果见图1。

在本研究中，采用甘草苷为对照品，以甘草苷的浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，测得甘草苷对照品的回归曲线为Y= 0.015 8X，R2=0.999 1，实验表明对照品质量浓度在20～100 μg・L-1与吸光度A呈良好的线性关系。检测栽培甘草根和甘草愈伤组织中总黄酮的含量，结果表明，5种诱导培养条件下获得的愈伤组织中总黄酮的质量分数为15～60 mg・g-1干重，比相同种属栽培甘草根中总黄酮的含量（GI为120 mg・g-1干重，GG为55 mg・g-1干重）要低很多。相同培养条件下，不同种属的甘草诱导的愈伤组织中总黄酮的含量不同，胀果甘草诱导的愈伤组织（处理A）中总黄酮为25 mg・g-1干重，高于光果甘草诱导的愈伤组织（处理B）中总黄酮的15 mg・g-1干重；24 h连续光照条件下诱导培养的愈伤组织（处理D）总黄酮的质量分数（60 mg・g-1干重）要远高于24 h黑暗条件下（处理C）培养的愈伤组织总黄酮（20 mg・g-1干重），这与杨世海等[9]利用乌拉尔甘草下胚轴为外植体在白色光照（荧光灯连续照射）和黑暗（24 h）培养愈伤组织进行有效成分分析时，得出的愈伤组织在光照条件下合成的黄酮类化合物的总量是黑暗条件下合成的化合物总量的2倍的结论一致。处理D，E的甘草愈伤组织中总黄酮含量都很高，但相差不大，见图1。在选取考察的5个诱导培养条件中，胀果甘草的子叶为外植体在光照下诱导时选取的这2个激素都比较适合进行甘草愈伤组织总黄酮的生产。实验结果采用单因素方差分析法（One-Way ANOVA）进行分析，甘草种属、外植体和光照条件对甘草愈伤组织中总黄酮的含量具有极其显著的影响，然而，激素组合对甘草愈伤组织中总黄酮的含量无显著影响，见表2。植物细胞中黄酮类化合物的合成受诱导培养条件的影响，这与杨世海等[10]以乌拉尔甘草胚轴为外植体，以不同类型的培养基、不同培养基pH、培养基中添加不同激素等条件诱导并培养甘草愈伤组织，得到的愈伤组织中黄酮类化合物的含量不同的结论一致。

2.2甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性的差异 本文采用中药指纹图谱相似度评价系统（2004，A版）通过比较愈伤组织样品HPLC图中的峰面积、峰数量计算HPLC图的相似度，从而获得其差异度。5种典型诱导培养条件下甘草愈伤组织的次生代谢产物的多样性组成的HPLC图。用7种甘草黄酮及三萜类化合物作为对照品检测诱导培养的甘草愈伤组织的化合物组成，结果显示活性次生代谢产物甘草苷[11]、异甘草苷、甘草素[12]、甘草查尔酮A[13]、甘草酸以及异甘草素[14]都存在于本实验中培养的甘草愈伤组织中，见图2。

采用中药指纹图谱相似度评价系统计算不同诱导培养条件下的愈伤组织指纹图谱间的相似度，差异度为1减去相似度值。首先，分析对甘草愈伤组织总黄酮含量具有极其显著影响的诱导培养条件（甘草种属、光照条件和外植体），结果显示，甘草种属（差异度=0.27）、光照条件（差异度=0.45）对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有非常显著的影响，诱导培养条件外植体（差异度=0.16）对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有显著的影响；接着，分析对甘草愈伤组织总黄酮含量无显著影响的诱导培养条件（激素组合），结果表明，激素组合对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有非常显著影响（差异度=0.37），见表2。

采用中药指纹图谱相似度评价系统还可以得出甘草愈伤组织指纹图谱之间的共有峰和非共有峰。分析对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性具有显著影响的诱导培养条件，结果显示不同的诱导培养条件下的甘草愈伤组织指纹图谱间共有峰及非共有峰的数量并没有显著的差别（A和B，A和C，C和D，D和E）。

进一步对甘草愈伤组织中的峰面积占总峰面积百分比大于5%的色谱峰进行分析，可以看出相同色谱峰在不同指纹图谱中的峰面积是不同的，即同一化合物在不同的愈伤组织中含量是不同的，例如化合物3和化合物6分别在诱导培养条件C，D中含量最高，每个指纹图谱中出现在38.17 min的化合物的峰面积都远远高于其他4种化合物的峰面积。分别将每个指纹图谱中5个化合物的峰面积相加在一起进行分析，结果显示对甘草愈伤组织中5种主要化合物的总含量影响由大到小依次为光照条件、激素组成、外植体和甘草种属。

综上所述，对甘草愈伤组织中总黄酮的含量具有显著影响的诱导培养条件对次生代谢产物的多样性也具有显著的影响[15]，对甘草愈伤组织中总黄酮含量影响小的诱导培养条件对次生代谢产物的多样性也有可能会有显著影响（表2），这是因为甘草愈伤组织中的次生代谢产物除黄酮外，还有许多其他的化合物。在这4种诱导培养条件中，光照条件对愈伤组织次生代谢产物的多样性的影响最显著（差异度=0.45），这可能是因为一些甘草次生代谢产物的基因只有在光照条件下才能表达，黑暗条件下这些基因不表达或黑暗条件抑制这些基因的表达[16]。

2.3甘草愈伤组织与人工栽培的甘草药材次生代谢产物多样性的比较 三年生胀果甘草和光果甘草中许多次生代谢产物的含量都高于甘草愈伤组织，然而，甘草愈伤组织中也有部分次生代谢产物的含量高于人工种植的甘草，如异甘草苷和甘草素见图2，3。以人工种植的胀果甘草的指纹图谱为对照图谱，计算典型诱导培养下的甘草愈伤组织指纹图谱与同种属的人工种植的胀果甘草根指纹图谱的相似度，进而计算差异度，结果处理A，C，D，E中的甘草愈伤组织与人工种植的胀果甘草的指纹图谱差异度分别为0.90，0.95，0.94，0.86；以人工种植的光果甘草的指纹图谱为对照图谱，处理B与它的指纹图谱差异度为0.92，可以看出甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性与人工种植的甘草药材之间差别极其显著。

3结论

本实验采用总黄酮化学分析和HPLC指纹图谱分析相结合的方法成功评价了典型诱导培养条件对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性的影响，不同诱导培养条件下的愈伤组织次生代谢产物的多样性也明显不同，光照条件（差异度=0.45）和激素组成（差异度=0.37）对愈伤组织次生代谢产物的多样性影响最大。比较甘草愈伤组织的指纹图谱和人工种植的甘草根的指纹图谱，可以发现一些新的色谱峰，至于这些色谱峰所对应的化合物是不是新的化合物，需要结合HPLC-MS-NMR等方法进一步分析，如果产生系列新的化合物可以进一步建立一个新的化合物库，为药用植物资源的深度开发提供来新的资源。

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Significant impact of different induction conditions on metabolic

diversity of callus cell lines of Glycyrrhiza sp.

LIU Feng-cai1， LV Jian-ming2， WU Xiu-zhen1，2， ZHANG Wei1，2*

（1.Department of Biochemical Engineering， School of Chemical Engineering， Tianjin University， Tianjin 300072， China；

2.Tianjin Acelbio Biotechnology Co.， Ltd.， Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，

Tianjin 300457， China）

[Abstract] The purpose of this study was to evaluate the impact of callus induction and culture conditions on secondary metabolic diversity of the callus cell lines of traditional Chinese medicinal plant Glycyrrhiza sp. （Glycyrrhiza） by combined chemical analysis and HPLC fingerprint. These callus induction conditions included two Glycyrrhiza species， two types of explants， light and dark conditions， and two combinations of hormones. The evaluation was firstly based on the contents of total flavonoids in the callus by chemical analysis and one way ANOVA. The content of total flavonoids in callus was significantly （P