胰蛋白酶
胰蛋白酶范文第1篇
【摘要】
目的认识苏木素对胰蛋白酶作用活性的影响及苏木素对胰蛋白酶作用的荧光性质。方法用酶活性法观察苏木素对胰蛋白酶活性的影响；用紫外光谱和荧光光谱研究苏木素对胰蛋白酶作用的光谱性质。结果苏木素对胰蛋白酶活性可产生竞争性抑制，抑制剂常数k1=6.13×10-5 mol/l；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力。结论苏木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所处环境的疏水性增强，使胰蛋白酶分子构象发生变化。
【关键词】 苏木素 胰蛋白酶 荧光光谱 紫外光谱 酶活性
中药苏木的主要成分苏木素(haematorylin)是组织、病理实验室中最常用的染色剂，可用于细胞核染色［1］。苏木素具有收缩血管、中枢抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消肿、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和动物肠道中一种重要的蛋白水解酶，从该酶被发现以来，人们对其进行了一定的研究，如用胰蛋白酶为催化剂对蛋白质进行降解的研究［3～5］。药物对胰蛋白酶作用的性质［6］及苏木素与dna作用的性质的研究已引起重视［7］。本文主要通过紫外和荧光光谱法研究苏木素与胰蛋白酶作用的性质，从而获得苏木素与胰蛋白酶作用时结构变化、所处微环境等信息，探讨苏木素与胰蛋白酶相互作用的机制，并对苏木素与胰蛋白酶作用活性的影响也进行了研究。
1 器材
1.1 仪器荧光分光光度计，美国cary eclipse（瓦里安）产品；双光束紫外可见分光光度计tu－1901，北京普析产品；ph－3c型酸度计，上海精密 科学 仪器有限公司产品。
1.2 药品牛胰蛋白酶（生化试剂），上海海洋生物技术有限公司产品；苏木素（生物染色剂bs），成都科龙化工试剂厂产品；硼酸（分析纯 ），成都科龙化工试剂厂产品。
2 方法
2.1 苏木素对胰蛋白酶活性影响在恒温水浴箱中将酪蛋白、胰蛋白酶和苏木素预热，按酶活性的测定方法，在胰蛋白酶与酪蛋白的酶解反应体系中加入不同体积的苏木素溶液，测定苏木素对酶活性的影响。胰蛋白酶活性及抑制常数测定参照 文献 ［8］方法操作。
2.2 苏木素对胰蛋白酶紫外光谱的影响配制ph＝7.5的硼酸缓冲溶液（内含0.1 mol/l cacl2维持离子强度）；用硼酸缓冲溶液配制1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液，再用3次蒸馏水分别配制2.0×10-3mol/l和1.0×10-3mol/l的苏木素溶液。
室温条件下，在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液3.0 ml，扫描190～350 nm的吸收光谱。然后用微量注射往其中准确加入1.0×10-3mol/l的苏木素溶液10 μl，混匀，静置2 min后扫描190～350 nm的吸收光谱。扫描1.0×10-3 mol/l苏木素溶液190～350 nm的吸收光谱。
2.3 苏木素对胰蛋白酶荧光光谱影响在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入 1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液3.0 ml，用微量注射器分别加入2.0×10-3mol/l的苏木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 μl。每次加入后混匀，放置5 min，分别在20，25，30，35℃下，测定其荧光光谱，激发波长为280 nm，绘制288～450 nm的荧光光谱。
2.4 苏木素对胰蛋白酶作用的同步荧光将“2.3”项下所配的温度为298 k的溶液，固定激发和发射波长间隔λ分别为20 nm和60 nm，同时扫描激发和发射波长并记录同步荧光光谱。
3 结果
3.1 苏木素对胰蛋白酶活性的影响苏木素对胰蛋白酶有抑制作用，当苏木素浓度为4.5×10-4 mol/l时，苏木素使胰蛋白酶的相对活性下降到70.2%，抑制率为29.8%。在不同的底物浓度（40，30，20，10 g/l酪蛋白溶液）下，按酶活性的测定方法测定酶的反应速度，其结果以1/v对抑制剂量用dixon作图法求出ki=6.13×10-5mol/l，抑制类型为非竞争性抑制。
3.2 苏木素对胰蛋白酶紫外吸收光谱影响图1为t＝298k，ph＝7.4时的吸收光谱。蛋白质分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基均有紫外吸收，蛋白质的吸收波长一般在280 nm附近。从图1可以看出，当往胰蛋白酶中加入苏木素后，混合溶液在280 nm附近的吸收峰均明显增高，说明苏木素与胰蛋白酶之间发生了作用，改变了胰蛋白酶的构象,而这种作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基的π－π* 电子 跃迁。
3.3 荧光光谱以λex＝280 nm，胰蛋白酶在354 nm附近有很强的荧光峰；而以同样激发波长激发苏木素溶液，在354 nm附近则没有荧光峰，证明苏木素不会产生与胰蛋白酶干扰的荧光。固定胰蛋白酶的量，随着体系中苏木素浓度的增加，胰蛋白酶的内源荧光产生有 规律 的猝灭，其最大发射波长未发生明显的变化（见图2）。
3.4 荧光猝灭常数及猝灭机理
3.4.1 苏木素对胰蛋白酶的猝灭效应一般情况下，可依据不同温度下的结果区别是动态猝灭，还是静态猝灭。对于动态猝灭，随着温度升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧 电子 的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度的升高而增大。而对于静态猝灭则温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。本文以相同的实验条件，分别测定了在20，25℃ 下胰蛋白酶的荧光猝灭光谱，以［f0/f－1］对［c］作stern－volmer图见图3。从图3可以看出苏木素在温度低于25℃时猝灭常数随温度的升高而降低，即符合静态猝灭机理。
当猝灭体分子和荧光物质分子之间形成新的复合物而发生静态猝灭时，服从lineweaver-burk方程。20，25℃时以（f0－f）－1对［c］－1拟合lineweaver-burk方程，由图4可见该双倒数呈现良好的线性关系，再次确定在20，25℃时为静态猝灭。
3.4.2 结合位点数n及结合常数ka的 计算 设苏木素与胰蛋白酶形成n个结合点位的复合物则有：
lg［（f0－f）/f］＝lgka+nlg［c］
分别作不同温度下lg［（f0－f）/f］－lg［c］的双对数拟合，得到不同温度下的ka和n见表1。表1 苏木素与胰蛋白酶的结合常数，结合位点数及相应的相关系数（略）
3.4.3 作用力类型的确定猝灭体与生物大分子之间的相互作用力主要有氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力。根据以下公式计算。结果见表2。表2 苏木素与胰蛋白酶作用的热力学参数（略）
ln(k2/k1)=h(1/t1-1/t2)/r
g=-rtlnk
s=(h-g) /t
由上可知，h＜0和s＜0，可以说明苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力［9］。
3.4.4 苏木素对胰蛋白酶构象的影响固定激发波长与发射波长的间距λ，扫描同步荧光光谱，这种光谱可用于蛋白质构象变化的分析,由(a)λ＝20 nm所得到的同步荧光光谱图仅显示的是酪氨酸残基的荧光，(b)λ＝60 nm时仅表现出色氨酸残基的荧光，由图5可以看出在此实验条件下，酪氨酸和色氨酸残基荧光同时被猝灭，使其荧光强度下降，酪氨酸残基的最大发射波长没有发生改变，但色氨酸残基的最大发射波长发生了蓝移，表明色氨酸基所处环境的疏水性增强，引起了胰蛋白酶的构象变化。
4 结论
苏木素对胰蛋白酶活性可产生非竞争性抑制，抑制剂常数ki=6.13×10-5mol/l；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭，说明苏木素能与胰蛋白酶形成复合物；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力；苏木素与胰蛋白酶可发生作用，改变了胰蛋白酶的构象，而色氨酸所处环境的疏水性增强显著。
【 参考 文献 】
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胰蛋白酶范文第2篇
（大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023）
摘要：以壳聚糖为载体固定化胰蛋白酶，制备牡蛎肽，然后以肽得率为指标，分别研究了pH值，酶加量，酶解时间和温度等单因子对固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白质的影响。实验结果表明，酶解牡蛎蛋白的最佳工艺条件是：底物浓度为200 μg/mL，加固定化胰蛋白酶量7 mg/3 mL，酶解时间3 h，pH 8.0，温度40 ℃。在此条件下水解牡蛎蛋白，肽得率可达到20.39%。
关键词 ：壳聚糖；固定化；胰蛋白酶；牡蛎；肽
基金项目：大连海洋大学大学生创新创业训练计划项目。
作者简介：牛红鑫，女，本科生，研究方向食品质量与安全。
通讯作者：佟长青，男，副教授，E-mail：changqingtong@dlou.edu.cn；李伟，男，教授，Tel: 0411-84763553；E-mail: aisingioro@hotmail.com。
DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2015.09.003
牡蛎（Crassostrea gigas）是我国重要的养殖贝类品种。牡蛎具有丰富的营养，还有一定的药用价值。近年的研究表明，牡蛎肽具有多种多样的生物活性。Wang等利用枯草杆菌蛋白酶从牡蛎中制备的牡蛎肽具有抗氧化活性，经过HPLC分离获得了抗氧化活性牡蛎肽PVMGD和QHGV[1]。其它的还有刺激免疫细胞增加IL-2作用、抑制ACE酶活性以及抗菌活性[2-4]。因此牡蛎肽是一种重要的生物活性物质，可以应用于保健食品领域。
酶解法是制备肽的常用方法，固定化酶的方法也是常用的酶解工艺[5]。固定化酶具有可以重复使用、生产成本低的优点。本文以肽得率为指标，研究利用壳聚糖固定化胰蛋白酶制备牡蛎肽的最佳工艺条件。研究结果将为牡蛎肽的制备提供一些有益的数据。
1材料与方法
1.1材料
牡蛎购于大连长兴农贸市场。
胰蛋白酶（1:250）购于北京索莱宝科技有限公司；壳聚糖购于浙江金壳生物化学有限公司。其他试剂为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1固定化胰蛋白酶的制备按张金铃等的方法进行壳聚糖固定胰蛋白酶的制备[5]。在0.2 g壳聚糖上固定了20 mg的胰蛋白酶，活力为314 U。
1.2.2牡蛎肽的制备取新鲜牡蛎，去除内脏，加入0.9%的NaCl溶液并进行匀浆，置于4 ℃抽提过夜。在4 000 r/min条件下离心20 min，获得上清液。
将一定量的壳聚糖固定胰蛋白酶加入到上清液中进行酶解，在不同底物浓度、温度、pH、加固定化胰蛋白酶量以及时间等条件下，测定肽得率。
1.2.3肽得率测定采用Folin-酚法测定上清液中的蛋白含量。酶解液经三氯乙酸（TCA）沉淀后，上清部分用Folin-酚法测定，即是肽的含量。肽得率（%）=上清液肽含量/蛋白含量。
2结果与讨论
2.1不同的壳聚糖固定胰蛋白酶加酶量对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，分别加入3、4、5、6、7、8 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图1。由图1可知，随着固定化胰蛋白酶量的增加，肽得率逐渐升高，且在固定化胰蛋白酶用量为6 mg/3 mL后，肽得率增加较慢。
2.2pH对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH分别为5、6、7、8的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，各加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图2。由图2可知，随着pH值的增加，肽得率先升高后降低，且在pH值为8时，肽得率最大。
2.3温度对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，分别于25、30、35、40、45、50、55 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图3。由图3可知，随着酶解温度的增加，肽得率先升高后降低，且在温度值为40 ℃，肽得率最大。
2.4底物浓度对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度分别为100、150、200、250、300 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图4。由图4可知，随着底物浓度的增加，肽得率逐渐升高，且在底物质量浓度为200 μg/mL后，肽得率增加较慢。
2.5酶解时间对菲律宾蛤仔酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃分别水浴酶解1、2、3、4、5、6 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图5。由图5可知，随着酶解时间的延长，肽得率逐渐升高，且在3 h后，肽得率增加较慢。
2.6壳聚糖固定胰蛋白酶最佳水解条件的确定
影响酶解反应的几个主要因素为固定化酶量、酶解时间、pH、温度和底物浓度。根据上述单因素试验分析，并考虑生产成本等因素，酶解温度40 ℃，底物浓度200 μg/mL，以肽得率为指标做壳聚糖固定胰蛋白酶量、pH、酶解时间3因素3水平的正交试验L9 (33 )，正交试验的因素水平见表1，正交试验结果见表2。
由表2可知，各因素对壳聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律宾蛤仔蛋白的肽得率影响大小顺序为A＞B＞C，即：酶加量＞pH＞酶解时间，最优水平为A3B3C2，即：pH为8.0，壳聚糖固定胰蛋白酶量为7 mg/3 mL，酶解时间3 h。
因此确定壳聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律宾蛤仔低分子量蛋白的最佳条件为酶加量7 mg/3 mL，时间3 h，pH 8.0，温度40 ℃，底物浓度为200 μg/mL。在此条件下水解牡蛎蛋白，肽得率可达到20.39%。
3结论
壳聚糖固定胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白的最佳条件为酶加量7 mg/3 mL，时间3 h，pH 8.0，温度40 ℃，底物浓度为200 μg/mL。在此条件下水解牡蛎蛋白，肽得率可达到20.39%。
参考文献：
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胰蛋白酶范文第3篇
[关键词] 胰腺癌；血清胰蛋白酶原-2；CA199；CA50；CA242
[中图分类号] R735.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0054-04
胰腺癌是一种起病隐匿、进展速度快、预后极差的消化系恶性肿瘤，5年生存率在所有恶性肿瘤中最低，在美国仅为6%左右，即使已行早期根治性手术切除的患者5年生存率也只有24%，但因其起病隐匿，53%的患者发现时已有远处转移，5年生存率仅为0～2%[1]。在胰腺癌早期诊断方法中，肿瘤标志物检测方法简便、费用低廉，已被广泛应用于临床。目前比较普遍应用于胰腺癌诊断的血清学肿瘤标志物有CA199、CA50、CA242等。胰蛋白酶原-2，丝氨酸蛋白酶，绝大部分由胰腺腺泡分泌，以酶原的形式分泌到胰液中，Hedstr？m等[2]的研究提示，胰蛋白酶原-2可能与胰腺癌相关，本研究采用ELISA法定量检测胰腺癌、正常对照者血清中胰蛋白酶原-2、CA199、CA50、CA242含量，应用ROC曲线探讨其在检测胰腺癌中的应用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2009年12月～2011年6月总医院、2011年6月～2012年2月北京市石景山医院就诊内、外科未经治疗的胰腺癌住院患者25例为胰腺癌组，其中男14例，女11例，平均年龄（66.36±12.98）岁，入组前均未行手术及放化疗治疗，均由术后病理或影像学资料+长期随访证实。随机选取同期于总医院及石景山医院体检中心进行健康体检的35例为健康对照组，其中男20例，女15例，平均年龄（43.54±11.28）岁，均无明显上消化道症状及胰腺疾病病史；并排除其他肿瘤患者及孕妇、酗酒者、药瘾者。本研究获得上述两家医院伦理委员会伦理审查批准。
1.2 标本采集与检测
留取清晨空腹静脉全血4 ml，标本经1000×g离心后去上层血清分装至Eppendorf（EP）管冻存于-70℃，检测前1天将冻存标本于4℃冷藏室解冻，检测前取出放置室温（20℃）1 h，应用标准ELISA操作流程（双抗体夹心法）检测，采用全自动多功能酶标仪及相应检测统计软件进行分析，胰蛋白酶原-2及CA199、CA242、CA50检测试剂盒由北京永瀚星港生物技术有限公司惠赠，酶标仪为全自动多功能酶标仪（OLY- MPUS5421全自动生化分析仪）。
1.3 统计学处理
应用SPSS 16.0统计学软件处理数据，绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线），找出最佳截断点（ROC曲线上最左上方的点，此时灵敏度及特异度均较高，或根据文献设定的临界值选取临界点），因数据呈非正态分布，采用中位数、四分位数间距描述各组结果。
2 结果
各肿瘤标志物ROC曲线如图1。
图1 各肿瘤标志物ROC曲线
胰蛋白酶原-2：AUC=0.988，P
2.1 血清胰蛋白酶原-2鉴别正常人和胰腺癌的灵敏度和特异度
以点SEN 0.960（1-SPE 0.086）为最佳临界点，其对应的临界值为1.85 ng/ml，ROC曲线下面积为0.988（P
表1 两组血清胰蛋白酶原-2含量的检测值（ng/ml）
M：中位数；QL-QU：四分位数间距；Min-Max：最小值-最大值
2.2 CA199鉴别正常人和胰腺癌的灵敏度和特异度
当前通常以37 U/ml作为胰腺癌诊断临界值，本试验选取最接近点SEN 0.88（1-SPE 0.171），相应临界值为37.20 U/ml，ROC曲线下面积为0.906（P
表2 两组血清CA199含量的检测值（U/ml）
M：中位数；QL-QU：四分位数间距；Min-Max：最小值-最大值
2.3 CA50鉴别正常人和胰腺癌的灵敏度和特异度
当前通常以20 U/ml作为胰腺癌诊断临界值，本试验选取最接近点SEN 0.72（1-SPE 0.200），相应临界值为19.68 U/ml，ROC曲线下面积为0.833（P
表3 两组血清CA50含量的检测值（U/ml）
M：中位数；QL-QU：四分位数间距；Min-Max：最小值-最大值
2.4 CA242鉴别正常人和胰腺癌的灵敏度和特异度
当前通常以20 U/ml作为胰腺癌诊断临界值，本试验选取最接近点SEN 0.68（1-SPE 0.143），相应临界值为20.45 U/ml，ROC曲线下面积为0.834（P
表4 两组血清CA242含量的检测值（U/ml）
M：中位数；QL-QU：四分位数间距；Min-Max：最小值-最大值
3 讨论
胰腺癌是预后极差的恶性肿瘤，近年我国胰腺癌发病率明显上升，且多数胰腺癌确诊时已属中晚期，失去了最佳治疗时机，预后差[3]。Pelaez-Luna等[4]回顾性分析45例胰腺癌患者114次CT扫描（胰腺癌诊断时或诊断前），发现在临床诊断胰腺癌前6个月做CT扫描，部分未检测到病变，部分为可切除性病变，但有临床症状患者几乎均属于不可切除性胰腺癌，提示在胰腺癌临床诊断前，仅有6个月的时间窗，此时病灶多数可切除。但多数无症状者，一般不会就诊，故“因症就诊”者是不太可能检测到真正意义上的早期可治愈的胰腺癌的，必须对无症状者进行筛查才有可能发现早期胰腺癌[5]。肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞及体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质，已被广泛应用于临床，在肿瘤的诊断和预后判断中发挥了巨大作用。糖类抗原CA199是一种非特异性的肿瘤相关抗原，在胰腺癌患者血清中升高最为显著[6]，是当前国内外应用最广泛的胰腺癌肿瘤标志物[7]。CA50是一种缺少岩藻糖残基碳水化合物的糖蛋白，其构型与CA199有相似的抗原决定簇，Lewis抗原阳性或阴性的人种均能检测出，故认为CA50对肿瘤的识别谱较CA199更为广泛[8]。CA242主要存在于胰腺和结肠恶性肿瘤细胞中，是不同于CA199和CA50的唾液酸化糖酯类抗原，它的单克隆抗体与Lewis-a血型物质及唾液酸化的半乳糖苷均不发生反应，在胰腺癌中有较高的特异度、灵敏度。胰蛋白酶原-2，绝大部分以胰腺腺泡酶原的形式分泌到胰液中，并在肠内被肠激酶激活。近年来发现，胰蛋白酶原-2在一些肿瘤细胞中呈高表达[9-12]。本试验胰腺癌组胰蛋白酶原-2含量明显高于正常组，提示血清胰蛋白酶原-2与胰腺癌关系密切。本文采用ROC曲线对胰蛋白酶原-2、CA199、CA50、CA242在诊断胰腺癌中进行分析，结果显示，胰蛋白酶原-2鉴别胰腺癌与正常人曲线下面积为0.988，以1.85 ng/ml为临界点，灵敏度为96%，特异度为91.4%。CA199鉴别胰腺癌与正常人曲线下面积为0.906，以37.2 U/ml为临界点，灵敏度为88%，特异度为82.9%。CA50鉴别胰腺癌与正常人曲线下面积为0.833，以19.68 U/ml为临界点，灵敏度为72%，特异度为80%。CA724鉴别胰腺癌与正常人曲线下面积为0.834 U/ml，以20.45 U/ml为临界点，灵敏度为68%，特异度为85.7%。
本试验中可见4种标志物ROC曲线下面积，胰蛋白酶原-2最高，其次为C199，CA242和CA50接近，均>0.5，提示以上肿瘤标志物用于诊断胰腺癌均有一定的临床意义。据文献报道及临床试验观察，提示各自有其局限性：CA50无器官特异度，多种肿瘤中均可增高，尤其是胃肠癌，在肝胆疾病患者，尤其是黄疸中也升高[7]，因此单独测定CA50对胰腺癌的诊断意义较小。Kawa等[13]认为，CA242比CA199和CA50更特异，在胰腺炎、慢性肝炎和肝硬化等良性疾病中也很少升高，并且不受肝实质损害、胆汁淤积的影响，但也有文献报道CA242、CA50的灵敏度和特异度均不优于CA199[14]。尽管CA199是目前对胰腺癌灵敏度最好的标志物[7]，但在Lewisa阴性基因人群中无法表达，因此此血清型的肿瘤患者表现为CA199阴性。此外，急慢性胰腺炎、胆囊炎、胆管阻塞、肝炎、肝硬化等疾病中，CA199也有不同程度的升高，且在分化差的肿瘤中表达也较低[15-16]。目前鲜有关于胰蛋白酶原-2与胰腺肿瘤大小、病情严重程度、病理分期相关性，及是否能预测胰腺癌预后、评价治疗效果的研究报道，且有文献报道[17]胰蛋白酶原-2在急性胰腺炎患者血清中呈现高表达，因此，胰蛋白酶原-2也非胰腺癌绝对理想指标。目前尚未发现单一理想诊断胰腺癌的肿瘤标志物，近年倾向于将灵敏度、特异度较高的肿瘤标志物联合检测。
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胰蛋白酶范文第4篇
【关键词】 豆豉；，，胰蛋白酶抑制剂；，，分离纯化；，，降糖作用
摘要：目的从豆豉中提取胰蛋白酶抑制剂，并探讨其降血糖活性。方法以永川豆豉为材料，经脱脂，酸性溶液提取，硫酸铵沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物，再经Sephadex G-75凝胶层析得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，以纯化的胰蛋白酶抑制剂给糖尿病小鼠灌胃并观察其降血糖活性。结果从豆豉里分离出的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率为30%~40%；用抑制剂提取液给四氧嘧啶糖尿病模型小鼠连续灌胃4 d，发现其血糖值明显低于模型组；观察小鼠的胰组织病理切片，与糖尿病小鼠比较，灌胃后的小鼠胰组织明显得到修复。结论 豆豉提取液有较明显的降糖作用。
关键词：豆豉； 胰蛋白酶抑制剂； 分离纯化； 降糖作用
Purification A Trypsin Inhibitor from Lobster Sauce Produced in Yongchuan and Hypoglycemic Action of Research
Abstract：ObjectiveTo isolate and purify the trypsin inhibitor from Lobster sauce and investigate its hypoglycemic action.MethodsA trypsin inhibitor was purified from the lobster sauce of Yong Chuan by defatting，extraction with axidic buffer，precipitation，chromatography on Sephadex G-75， and its hypoglycemic action in mice was studied.Results A series study on lobster sauce showed that the inhibitor had inhibition activity of thirty~forty percent to trypsin. In mesoxalyl carbamide model，the blood glucose levels were reduced after four days treated with lobster sauce extracts of Yong Chuan， compared with the model group.ConclusionThe trypsin inhibitor has hypoglycemic action.
Key words：Lobster saace； Trypsin inhibitor； Isolation and purification； Hypoglycemic action
蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物和微生物中，具有抑制蛋白酶的活性的作用，能与相应的蛋白酶水解，参与体内许多重要生理过程的调节。其中胰蛋白酶抑制剂具有重要的药用价值，对于急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效［1］。蛋白酶抑制剂被认为是植物天然的自我防御体系，是植物抗病基因工程的重要目的基因来源［2］。大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）与其它临床上广泛应用的胰蛋白酶抑制剂具有相似的性质，但其生理活性研究还没得到足够的重视。和其他胰蛋白酶抑制剂相比，大豆胰蛋白酶抑制剂具有分子量较小、免疫反应较弱、植物来源的抑制剂能避免携带动物病毒、原料来源广、价格低廉等优点，应当得到足够的重视。大豆胰蛋白酶抑制剂的种类有7~10种，目前研究证明主要有两种在动植物体内能抑制胰蛋白酶活力：一种为鲍曼克抑制剂(BBI)，是由71个氨基酸组成的多肽，分子量为7 975，分子内有7个二硫键，另一个为库尼兹抑制剂（KSTI），分子量约2万，分子内有2个二硫键。近年来国外报道发现低浓度的BBI在动物体内对直肠癌、肝癌等多种癌症有抑制作用；另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果［3］，但未见有降血糖作用的详尽报道。因此，对具有强抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑制剂，从豆豉中分离纯化，使其成为抗癌、治疗糖尿病及其并发症的新药用于临床，有十分积极的意义。
1 仪器与材料
DS1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）， KDC1042离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），AE240电子天平（METTLER公司）；雄性昆明种小鼠（体重18~22 g），永川豆豉(市售咸豆豉) ，透析袋，牛胰蛋白酶(1∶250) 、BAPNA・HCl(购自上海维思科贸有限公司)， Tris( 成都化学试剂厂生产)，sephadexG75 (上海化学试剂厂生产)，四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司)，葡萄糖试剂盒GLU（氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司），肝素钠（天津生物化学制药厂），其它试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化
2.1.1 豆豉胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋白酶抑制剂对热酸环境相对稳定，一般采用水浸酸提、沉淀再经离子交换或凝胶层析纯化制得。取2 kg永川豆豉，于46℃恒温干燥9 h，干燥后置于干净托盘中，把干燥豆豉粉碎、称重，然后加入去离子水2 L，于0℃提取15 h。15 h后于3 000 r/min离心6 min，沉淀弃去， 收集上清液。取上清液，加入正己烷［正己烷∶上清液(1∶2)］，静置30 min，后用1 000 ml的分液漏斗分离上述混合液，回收正己烷，收集棕色豆豉提取液。用稀盐酸20%(v/v)调豆豉提取液的pH约为4，于55℃水浴中保温1 h。称取固体硫酸铵，分次少量加入于水浴的上清液里，使硫酸铵的饱和度为30%，继续于55℃的水浴恒温15 min，离心15 min（3 800 r/min），弃去沉淀，留上清液。在上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵的饱和度为55%，55℃保温10 min，再离心15 min，弃去沉淀，收集上清液。再于上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵溶液的饱和度为70%，55℃恒温10 min，离心30 min（12 000 r/min），弃去上清液，收集沉淀，用20 ml磷酸盐缓冲液（pH 7.8）溶解沉淀，沉淀即为抑制剂粗提物［4］，于4℃保存在冰箱里。
2.1.2 抑制剂粗提物的透析将抑制剂粗提物置于透析袋中蒸馏水充分透析7 d，除去盐分。
2.1.3 凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化［5］取层析柱（16 mm×60 cm)洗干净并烘干。称取12.5 g sephadex G75溶解在250 ml 0.05 mol・L-1 pH 7.8的磷酸缓冲液中，充分混匀后，在100℃水浴中蒸煮5 h，赶走气泡，将凝胶连续沿壁缓缓倒入层析柱中，待有2 cm沉淀后，打开柱子下端的出口。稳定以后在凝胶的上缘留2~3 cm缓冲液，并放一个面积相当的滤纸片，吸出存留缓冲液，加入5 ml样品，连上缓冲液，打开出口阀，控制流速在2 ml/h。流出30 ml后，用干净的试管分部收集（2~3 ml），检测每管的抑制剂活性。
2.1.4 BAPNA法测定胰蛋白酶抑制剂活性 参考文献［6］略加改进，取不同胰蛋白酶抑制剂制备物并与0.2 ml胰蛋白酶溶液（0.1mg/ml）混合，于5 ml TrisHCl缓冲液（pH 8.0，0.05 mol・L-1）中37℃保温5 min，加入BAPNA 2.5 ml（5 mmol・L-1），于37℃恒温10 min，立即加入0.5 ml 33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样做对照，410 nm处测定吸光度值。每降低0.1个A410 nm为一个BCTI抑制活性单位（U）。
图1 豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率（略）
由图1可看到纯化过的豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制作用是较强的，是一种抑制力较强的抑制剂。
2.2 抑制剂提取物对小鼠血糖水平的影响
2.2.1 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立取雄性昆明种小鼠（体重18~22 g），随机分为3组。每组10只，分别为正常对照组、四氧嘧啶高血糖模型组、抑制剂提取物灌胃组。高血糖模型组及高血糖模型灌胃组禁食10 h。按200 ml/kg的用量，腹腔注射四氧嘧啶。72 h后人工断尾取血，选取空腹血糖值大于11.0 mol・L-1的小鼠作为高血糖模型小鼠。
2.2.2 豆豉胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平的影响高血糖模型灌胃组按每天0.3 ml/只用量经口服灌胃给药4 d。正常组和高血糖模型组每天注射等剂量的生理盐水。每日观察小鼠皮毛、活动等生长情况。末次给药后，所有动物禁食10 h，按试剂盒方法测定血糖值。
表1 豆豉胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖水平的影响（略）
P＜0.001
由表1可见，第1天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型组有所降低，第4天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型组明显降低，说明豆豉胰蛋白酶抑制剂提取物有较明显的降血糖作用。
2.2.3 豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰组织的影响处死小鼠，分别取四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃前后的胰腺组织做病理切片（HE染色），显微镜下观察，结果如图2~3。 由图2~3可见，四氧嘧啶高血糖模型小鼠胰组织严重病变，灌胃后小鼠胰组织形态好于四氧嘧啶高血糖模型组织，胰岛结构较清晰，边缘与周围腺胞界限明显。说明豆豉胰蛋白酶抑制剂提取液对胰岛组织有明显的修复作用。
图2 抑制剂灌胃后小鼠胰组织 （略）
图3 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰组织（略）
3 讨论
据报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调有一定效果。我们在实验中观察到豆豉胰蛋白酶抑制剂提取液有降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的作用。我们尚在本实验中做了豆豉胰蛋白酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶活性抑制实验，结果显示无抑制活性作用。提示其降糖机理可能不是通过影响胰岛素受体后糖代谢的环节，而可能是通过保护或修复胰岛β细胞及胰岛组织促进胰岛素分泌或释放起作用的［7］。可能是豆豉提取液中胰蛋白酶抑制剂对胰腺产生了一定作用，促进胰岛素的释放，从而降低了血液中葡萄糖的浓度，但降糖作用机理尚有待再进一步分析研究。
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胰蛋白酶范文第5篇
【摘要】 目的 探讨重组蛋白酶抑制剂(recombinant proteinase inhibitor，RPI)对大鼠胰腺缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法 Wistar大鼠30只随机分为假手术组、I/R模型组和RPI组，分别测定各组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶含量。检测各组血清中肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β) 的变化。结果 RPI组的淀粉酶、脂肪酶含量较模型组显著降低(P
【关键词】 胰腺;缺血再灌注;重组蛋白酶抑制剂;淀粉酶;肿瘤坏死因子α
胰腺移植能增加患者胰岛素分泌细胞，从而有效地控制血糖，防止和改善糖尿病的并发症。早期胰腺炎是胰腺移植术后的常见并发症，而缺血再灌注(I/R)损伤是引起移植胰腺炎的主要原因，因此术后使用高效治疗胰腺炎的药物可取得较好的效果。重组蛋白酶抑制剂(RPI)是含有Kunitz结构域(Kunitz domain)的一个片段(289～345)，由57个氨基酸残基组成多肽，具有Kunitz型丝氨酸蛋白水解酶抑制(KPI)活性，能够有效地抑制胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶、胰血管舒缓素等蛋白水解酶的活性。研究表明，成功地利用DNA重组和分子克隆技术制备重组人Kunitz型RPI优选的表达系统是巴斯德毕赤酵母表达系统〔1〕，并通过药效学实验证实RPI对急性胰腺炎有明显的治疗作用〔2〕。本研究旨在观察RPI在胰腺I/R损伤的保护作用，为临床防治胰腺I/R损伤提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物、试剂及仪器 Wistar大鼠30只，雌雄兼用，由吉林大学医学动物研究中心提供。RPI由吉林大学药学院制备。淀粉酶和脂肪酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。COLE PARMERP酶标仪 (新加坡 ) TJ6低温高速离心机(美国BACPKMA公司);2700型生化分析仪(日本SANYO公司);KUBOT KR2000T高速离心机(日本)。
1.2 动物模型与分组 术前实验动物禁食 12 h，自由进水，随机分为假手术组、I/R模型组和RPI组。术前30 min假手术组、I/R模型组尾静脉推注生理盐水1 ml，RPI组尾静脉推注RPI(8×104 kIU/kg) 。3%戊巴比妥钠 30 mg/kg腹腔注射，腹正中切口，分离胃脾韧带，结扎脾门血管，夹持脾脏，将胃翻向大鼠右侧，暴露膈肌与左肾动脉之间的腹主动脉，游离腹腔干至脾动脉，用无创动脉夹闭脾动脉，造成胰腺体尾缺血模型，30 min后松开动脉夹进行再灌注，松开动脉夹前各组按上述方法再次给药 1 次。假手术组以相同的手术方法切开显露腹腔干及脾动脉，但不夹闭血管。再灌注时间均为 6 h。
1.3 大鼠血清淀粉酶(AMY)和脂肪酶(Lipase)测定 各组动物分别在再灌注后 6 h腹主动脉取血约 3 ml，2 000 r/min 离心 10 min，分离血清，测定血清AMY、Lipase。
1.4 大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(白介素1β)的测定 标本采集同1.3，分离血清，采用ELISA方法测定血清TNFα、IL1β，具体步骤按试剂盒要求进行。
1.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件，实验数据以x±s表示，各组数据的均数比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 RPI对胰腺I/R损伤大鼠血清AMY和Lipase的影响 I/R模型组大鼠血清AMY及Lipase含量均明显增高，与假手术组比较具有显著性差异。RPI组与I/R模型组比较，大鼠血清AMY及Lipase含量均明显降低(P
2.2 RPI对胰腺I/R损伤大鼠血清TNFα和IL1β的影响 I/R模型组大鼠血清TNFα和IL1β水平均明显增高，与假手术组比较差异显著(P
3 讨 论
I/R损伤是造成胰腺移植后各种并发症的主要原因之一，如移植术后早期胰腺炎、移植术后胰岛细胞功能不良，这些都大大降低了胰腺移植的效果〔3〕。I/R损伤的具体发病机制复杂，目前认为与能量代谢障碍、 氧自由基的产生以及中性粒细胞激活并释放炎性细胞因子等有关〔4〕。
基因工程制备的RPI是一种小分子量β淀粉样蛋白前体(APP)，包含一段KPI结构域，具有强抑制活性，氨基酸序列与KPI家族的抑肽酶43%同源性，具有与KPI相同的生物学活性和药理作用。本研究中通过建立大鼠胰腺I/R损伤模型后，血清AMY和Lipase明显升高，而给予RPI治疗后则明显降低，说明RPI可有效地抑制胰酶的分泌和释放。
另外炎性细胞因子的释放在胰腺I/R损伤的病理生理中起重要作用。炎性细胞因子主要由机体的免疫细胞分泌，在各种因素刺激如感染、 外伤、 缺血后其表达可急剧增加，过度表达可导致或加重组织损伤〔5〕。其中，TNFα 和 IL1β 已被普遍认为是介导胰腺I/R损伤的主要细胞因子，其水平异常增高时，可直接作用于细胞，使组织细胞溶解;作用于中性粒细胞时，刺激中性粒脱颗粒，生成自由基，释放各种蛋白酶和其他水解酶，诱导细胞凋亡，造成局部组织损伤和毛细血管通透性增高，进一步加重微循环障碍，微循环障碍反过来又诱发炎症介质的释放。本研究也显示，RPI可明显降低I/R模型组血清TNFα、 IL1β，说明胰腺I/R后，RPI通过抑制炎性细胞因子的作用而达到对胰腺I/R的保护作用。
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