巨噬细胞
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巨噬细胞范文第1篇
巨噬细胞活化综合征(macrophage activation syndrome,MAS)是儿童慢性风湿性疾病的严重并发症,临床主要表现为持续发热,淋巴结及肝脾肿大,全血细胞减少,严重肝功能损害,凝血障碍及神经系统受累等多脏器病变,骨髓细胞学显示有分化良好的巨噬细胞吞噬血细胞现象[1]。1985年Hadchouel等[2]。第一次报道了soJIA患儿病程中出现类似MAS的临床表现,提示可能与大量异常活化的非肿瘤性巨噬细胞所致的噬血细胞现象相关。1993年Stephan等[3]首次提出了MAS的概念,他们发现这些患者存在单核巨噬细胞活化,临床表现与噬血性淋巴组织细胞增生症(HLH)相似。随后MAS这个概念逐渐被风湿病学界认识和接受,关于MAS的报道也逐渐增多,近年来其他风湿性疾病如系统性红斑狼疮、皮肌炎、川崎病、渗出性多形性红斑等[4]也有合并MAS的报道。现就巨噬细胞活化综合征近年来的研究进展做一综述。
1 MAS的流行病学特点
MAS是风湿性疾病少见的并发症,目前尚无确切的关于MAS发病率的统计数据。随着MAS研究的不断深入,MAS的报道越来越多。胡坚等[5,6]对幼年特发性关节炎(juvenileidiopathic arthritis,JIA)并发MAS的个案报道是国内最早的文献资料,随后人们开始关注到MAS在幼年特发性关节炎全身型(soJIA)中并不少见[7-9]。Sawhne等[10]。报道103例全身型JIA患者中有7例合并MAS。Emmennegger等[11]。对反应性HLH患者进行同顾性研究发现约1/3的HLH患者满足JIA的诊断标准。目前认为MAS男女发病率没有明显差异,没有种族易感性,任何年龄均可发病,以儿童发病多见,并且大部分MAS患者存在有基础病。
2 MAS的诱发因素
MAS发病确切的诱因尚不明确,可能与原发病活动、药物作用、感染等有关。任何感染均可诱发MAS,包括病毒、细菌、真菌及寄生虫等感染。EB病毒是诱发MAS最常见的感染因素,单纯疱疹病毒和巨细胞病毒等也被认为是引起MAS常见的诱因。近10年的文献资料显示在治疗soJIA过程中某些药物可能引发MAS,这些药物包括NSAIID类药物(阿司匹林、布洛芬等)、病情改善药物(金制剂、甲氨蝶呤等)、免疫抑制剂(如环磷酰胺)[13]和生物制剂(如TNF拮抗剂依那西普)[14、15]等。
3 MAS的发病机制
MAS确切发病机制目前尚不完全清楚,大部分关于MAS发病机制的假说都源于HLH。近年来研究发现,MAS的发病机制可能与穿孔素(perforin)基因异常表达和自然杀伤细胞(NK细胞)功能紊乱引发机体内细胞因子所致的瀑布反应有关[10-16]。穿孔素基因突变导致穿孔素蛋白表达减少[17],穿孔素蛋白是淋巴细胞、巨噬细胞和骨髓的前体细胞表达的一种蛋白质,它的主要作用是在细胞溶解过程中在细胞膜上形成小孔,引起靶细胞溶解。新近的研究也显示多次发生MAS的soJIA患者,大部分穿孔素蛋白表达降低。曾华松等口朝对7例So-JIA并发MAS患者的研究发现,穿孔素A91V基因均为野生型,未发现有突变基因,未发现广东地区汉族So-JIA并MAS患儿与穿孔素A91V基因多态性有关,考虑可能与个体特异体质有关。NK细胞在感染早期具有清除感染原作用,soJIA患者合并MAS中,NK细胞的数量和功能均降低。姚翠婵等[20]报道10例soJIA病情反复难治者,发现9例患儿外周血NK细胞CDl6+56+比率降低,这些患儿并发MAS机会明显增加,这也是soJIA患者容易并发MAS的原因[21]。当NK细胞功能下降,机体清除外来感染原能力降低,引起抗原驱动下T淋巴细胞持久激活和巨噬细胞活化因子大量产生,导致巨噬细胞过度活化释放大量炎症细胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α及干扰素α),即细胞因子瀑布,从而引起强烈自身免疫损伤[22],出现各种临床症状及实验室改变。对soJIA患儿检测其NK细胞功能及穿孔素蛋白表达水平,也许有助于预测MAS的发生。
4 组织病理学特征
MAS的组织病理学主要表现为T淋巴细胞及活化的巨噬细胞浸润。在骨髓及淋巴结中出现巨噬细胞噬血现象,浸润也可出现在其他组织和脏器。1988年,Reiner等[23]对MAS患者的尸解研究发现巨噬细胞浸润可出现在心脏、肝脏、胰腺、肾上腺及脑膜等。Billiau等[24]。报道了5例MAS患儿肝活检病理结果显示活化的CD8、T细胞和噬血细胞增生都参与了发病。
5 临床特征与实验室改变
5.1各系统临床表现MAS主要并发于soJIA,多数发生于疾病活动期,少数也可发生在疾病的静止期,个别病例甚至作为soJIA的首发症状[25]。MAS的起病非常急骤,进展迅速,其临床主要表现为多脏器受累症状,甚至出现多脏器功能障碍或衰竭。重症者预后差,病死率高。
发热常常是MAS的首发症状,主要表现为高热持续不退,多为稽留热,有时为弛张热。
肝脏受累在MAS中非常常见,表现为肝功能急剧减退甚至衰竭,出现恶心、呕吐、黄疸、出血倾向及肝酶短期内迅速升高,伴有肝脾进行性增大。
MAS最具有鉴别诊断意义的临床表现是中枢神经系统受累和出血顺向[26]。中枢神经系统受累表现为一系列中枢神经功能障碍,包括嗜睡、烦躁、定向力障碍、头痛、抽搐甚至昏迷等,部分患者出现颈项强直、肌张力异常(增高或降低),颅神经麻痹、失明、共济失调及偏瘫也不少见。出血倾向以皮肤黏膜出血为主要表现,类似于DIC,是MAS患者中最突出的异常表现,主要是凝血功能障碍所致,轻者表现为皮肤黏膜瘀点及瘀斑,较重的可有暴发性紫癜,鼻衄、消化道出血,甚至出现弥漫性血管内凝血(DIC)。
其他系统受累现象相对较少见。呼吸系统受累可出现呼吸衰竭,甚至急性呼吸窘迫综合征。肾脏受累表现为血尿,蛋白尿,少尿及无尿,部分患儿可以出现。肾功能衰竭。心脏受累表现包括心包炎、心肌炎,心力衰竭及心律失常等。以上器官受累一经发生往往提示多脏器功能受累,预后不良,曾华松等[19]报道提示MOt-的发生是MAS预后差的指征。
5.2 实验室改变MAS患者血象改变主要表现为白细胞、红细胞和血小板一系或者一系以上降低。肝酶升高如ALT、AST、LDH及GGT增高。胆红素轻度升高,以直接胆红素升高为主。血脂包括甘油三酯可以增高,低白蛋白血症,血氨水平多正常或轻度增高,血钠下降等。凝血功能异常可有PT及APTT延长,纤维蛋白原降低,FDP增高,D-二聚体升高,V因子轻度下降,维生素K依赖凝血因子缺乏等。血沉(ESR)降低是MAS特征性实验室改变。血清铁蛋白的明显升高也是MAS特征性改变之一。骨髓细胞学表现为反应性组织细胞增生,无恶性细胞浸润,极期可见吞噬红细胞、白细胞和血小板的吞噬性组织细胞。骨髓、淋巴结及肝脏活检可见分化良好的极度增生活跃吞噬了血细胞的吞噬细胞[24]。
6 诊断标准与鉴别诊断
6.1 诊断标准MAS目前尚无统一的诊断标准。2005年,Ravelli等[26]根据流行病学研究资料,提出了全身型JIA合并MAS的诊断指南,见表1。
表1SOJIA合并MAS的参考诊断指标(2005年)
临床标准
(1)CNS功能障碍(易激惹、定向力障碍、嗜睡、头痛、抽搐、昏迷)
(2)出血表现(紫癜、易出血、黏膜出血)
(3)肝睥增大(肋缘下≥3 cm)
实验室标准
(1)血小板≤262×109/L
(2)谷草转氨酶>59 U/L
(3)白细胞≤4.O×109/L
(4)纤维蛋白原降低(≤2.5 g/L)
组织学标准
骨髓有巨噬细胞吞噬血细胞的证据
诊断原则:诊断MAS需要任何2个或以上的实验室标准,3个或以上的临床和(或)实验室标准。骨髓中发现吞噬血细胞,仅仅是对于可疑病例才必须具备。
建议:上述诊断指标仅用于活动性s0JRA合并MAS,实验室检查值仅作为参考。
6.2 鉴别诊断诊断MAS必须排除其他疾病,如感染性疾病(如败血症、EB病毒感染),恶性疾病(如白血病、淋巴瘤及恶性组织细胞病),瑞氏综合症,以及药物副作用等。近年来人们认识到MAS与HLH的关系非常密切,临床上难以鉴别。HLH是组织细胞增生症的一种类型,是以表型良性分化的单核细胞聚集为特征的疾病谱。HLH分为两类,一类为原发性(家族性),是常染色体隐性遗传病,多散发;另一类为继发性(反应性),又分为感染相关性和肿瘤相关性HLH,多在儿童期发病,往往有明确诱发因素,比如EB病毒或巨细胞病毒感染。MAS的临床表现及组织病理特点与HLH非常相似,但有其特殊性。2004年,国际组织细胞协会将。MAS做为独立疾病单独列出,分类在继发性HLH中,特别强调与其他HIJH在治疗方案上的不同。2005年,美国血液病协会也将其单独描述,提出MAS与HLH的密切关系,强调HLH的诊断标准和治疗方案不一定符合MAS,提示了MAS的特殊性。虽然HLH及MAS两者的关系尚不清楚,在学术界上尚有争议,但随着对该病认识的不断深入,越来越多的学者认为MAS是属于组织细胞疾病范畴的风湿病相关性HLH[25-28]。
7 治 疗
MAS是全身型JIA一种严重并发症,有很高的病死率,做到早期诊断、早期治疗至关重要,可以极大的改善预后,已往报道病例多数在短期内临床治愈。目前常用的治疗方法包括一般治疗及特殊药物治疗。
7.1 一般治疗针对MAS发病的不同诱因,存在感染时进行抗感染治疗,及时停用可疑药物,针对患儿脏器功能状态做相应的呼吸循环支持等治疗。
7.2 药物治疗主要包括肾上腺皮质激素及环孢素A。轻症患儿口服泼尼松1～2mg/(Kg.d),症状体征及实验室指标好转后缓慢减量。重症患儿常常需要大剂量甲泼尼松龙冲击疗法,剂量为15～30mg/(Kg.d),最大剂量为lg/d,连续使用3～5天,之后改为口服维持,可降低巨噬细胞活化复发。环孢素A对一些巨噬细胞活化的疾病如HLH有明显效果[32,33],但其明确的免疫学机制并不十分确切。常用剂量为2～8mg/Kg.d,急性期应静脉用药,病情控制后改为口服治疗。此外,使用环孢菌素A还能避免肾上腺皮质激素的过度使用。用药期间应定期监测血药浓度及肾功能,据此调整治疗剂量。细胞因子拮抗剂如TNF受体拮抗剂依那西普(Etancerept)和LT拮抗剂阿那白滞素(Anakinra)也有一定疗效,但易致感染发生,用药前应明确有无感染存在。静脉输注丙种球蛋白(IVIG)、免疫抑制剂(如环磷酰胺等)、化疗药物(如VPl6)以及血浆置换治疗因疗效不确切,目前使用较少。新近开展的自体干细胞移植可能为MAS的治疗带来新的希望。
8 展 望
MAS是全身型JIA一种严重并发症,在临床上并不少见,早期诊断和早期治疗对其预后至关重要。虽然广大儿科医师已逐渐认识到MAS的重要性,但目前国内外尚没有关于soJIA合并MAS发病率的确切资料,对其发病机制也尚不清楚。因此,有必要开展前瞻性的多中心、大样本流行病学调查,以了解soJIA合并MAS的发病率;相信随着分子生物学和免疫学等现代医学的飞速发展,人们对MAS病因和发病机制的认识会不断清晰,对制订MAS的诊断标准将会更加科学合理;干细胞技术的出现和发展,将给MAS根治带来无限的希望。
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巨噬细胞范文第2篇
【摘要】 目的 探讨一种简便易行的小鼠巨噬细胞吞噬酵母菌实验的改良法。 方法 在巨噬细胞吞噬鸡红细胞和巨噬细胞吞噬酵母菌实验基础上建立一种新的吞噬实验方法。 结果 实验组吞噬10min的结果吞噬百分率57％，吞噬20min的结果吞噬百分率86％，吞噬30min的结果吞噬百分率63％。 结论 结果显示小鼠巨噬细胞吞噬酵母菌20min的吞噬百分率可高达86％，说明这种改良法简单而有效。
【关键词】 小鼠巨噬细胞；酵母菌；吞噬酵母菌实验改良法
The mice macrophage swallows the saccharomycetes experimental improvement method
【Abstract】 Objective Discusses one kind of simple macrophage to swallow the saccharomycetes method. Methods Swallows the chicken red blood cell by the macrophage and the macrophage swallows the saccharomycetes in the foundation newly to establish one kind to swallow experimental method. Results Experimental group，the phagocyte swallows saccharomycetes 10 minutes after to swallow the percentage to be possible to reach as high as 57%. The phagocyte swallows saccharomycetes 20 minutes after to swallow the percentage to be possible to reach as high as 86% . The phagocyte swallows saccharomycetes 30 minutes after to swallow the percentage to be possible to reach as high as 63%. Conclusion The result showed the mice macrophage swallows saccharomycetes 20 minutes after to swallow the percentage to be possible to reach as high as 86%，simply explains this kind of improvement method but to be effective.
【Key words】 mice macrophage；saccharomycete；swallows the saccharomycetes experimental improvement method
巨噬细胞对颗粒性抗原具有很强的吞噬功能，可用鸡红细胞、酵母菌等作为吞噬颗粒来观察其吞噬效果。多年来在实验课教学中，我们一直采用鸡红细胞作为吞噬颗粒，因为它具有个体大呈梭型，核明显并且着色清楚与其他细胞易区别的优点，但是也存在着一定的缺点，例如：费用高及血球制备比较麻烦等，再加上近年来高致病性禽流感的发生，在这种情况下，我们考虑到用酵母菌作为吞噬颗粒来观察其吞噬效果。经查阅有关资料，并结合我们的教学安排，考虑到整个实验所用的时间较长，以及所用的仪器设备对我们来讲在短期内解决都是个问题，面对这种情况，我们根据以往的实验课教学经验决定，在巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和巨噬细胞吞噬酵母菌实验这两个实验的基础上，探索一种时间短、简便易行的新方法来达到预期的效果，于是做了改良的小鼠巨噬细胞吞噬酵母细胞实验。
1 材料与方法
1.1 实验动物 ICR小白鼠，体重18 ～ 22g，雄性，由首都医科大学实验动物部提供，颗粒饲料喂养。分笼饲养于空调室内，室温（23±2）℃，相对湿度45%～65%，自由饮用自来水，自动控制昼夜各12h，自动换气通风。
1.2 实验材料 金黄色葡萄球菌、酵母菌均由首都医科大学病原生物学系提供。瑞氏染料、甲醇均由北京化学试剂厂提供。0.9％氯化钠注射液由石家庄四药有限公司提供。
1.3 方法
1.3.1 金黄色葡萄球菌的制备 将金黄色葡萄球菌接种到普通斜面培养基上，于37℃温箱培养后，每支培养基中加1ml的0.9 % 氯化钠注射液，反复吹打冲洗斜面培养物上的金黄色葡萄球菌，收集菌液，然后将收集到的菌液，参照标准比浊管用0.9％ 氯化钠注射液调至为3亿/ml菌的菌液，放4℃冰箱备用。
1.3.2 酵母菌菌液的制备 将酵母菌接种到沙氏斜面培养基上，于37℃温箱培养后，每支培养基中加1ml的0.9 % 氯化钠注射液反复吹打冲洗斜面培养物上的酵母菌，收集菌液，然后将收集到的菌液，参照标准比浊管用0.9 % 氯化钠注射液调至为10亿/ml菌的菌液，放4℃冰箱备用。
1.3.3 实验 将小白鼠分成6组，每组3只。第1、2、3组为对照组，经腹腔注射0.9 % 氯化钠注射液0.6ml/只，第4、5、6组为实验组，经腹腔注射3亿/ml的金黄色葡萄球菌菌液0.6ml/只。48h后将所有的小白鼠腹腔均注射10亿/ml的酵母菌菌液1ml/只。注射10min后、20min后和30min后，取对照组、实验组各一组小白鼠，行颈椎脱臼处死，轻轻按摩腹部后，消毒小鼠腹部皮肤，持镊提起腹中部皮肤并剪开，暴露腹膜，避开血管剪开腹膜一小口。用毛细吸管取出腹腔液，并收集于试管中。每组的每只小鼠取腹腔液滴于3张玻片，每张一滴，推片，自然干燥，固定。滴加瑞氏染液30min后，加等量蒸馏水，染3min后，水冲，滤纸吸干，在显微镜油镜下观察结果。并且计算吞噬百分率［1～4］。
2 结果
2.1 对照组 见图1。吞噬10mim的结果吞噬百分率5.5％，吞噬20min的结果吞噬百分率10％，吞噬30min的结果吞噬百分率7％。
转贴于
总之，小鼠巨噬细胞吞噬酵母菌实验的改良法简便而有效。
1 朱正美，刘辉. 简明免疫学技术. 北京：科学出版社，2002，206-207.
2 张子康，何光泽. 医学微生物学与免疫学实验教程.成都：四川科学技术出版社，1989，162-164.
3 靖学芳，赵文明. 医学免疫学和微生物学实验指导.北京： 首都医科大学，2003，6-7.
巨噬细胞范文第3篇
【关键词】 双歧杆菌DNA;，巨噬细胞;，蛋白激酶C;，核因子
Influence of bifidobacterium DNA on PKC and NFκB in murine macrophages
[Abstract] AIM: To explore the influence of DNA of bifidobacteriua adolescence on PKC and NKκB of murine macrophages. METHODS: The fluorescent intensity of PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε and PKCζ in murine peritoneal macrophages was detected by using laser confocal microscope. The density of NKκB+ macrophages was detected by immunocytochemical staining. RESULTS: The average fluorescent intensity of PKCα and PKCβII produced by mouse peritoneal macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P0.05）. The density of NKκB+ macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P
[Keywords]bifidobacterium DNA; macrophage; protein kinase C; nuclear factorκB
[摘 要] 目的: 探讨青春型双歧杆菌的DNA对巨噬细胞中6种PKC和NFκB的影响。方法: 通过激光共聚焦显微镜观察小鼠腹腔巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的荧光强度， 以免疫细胞化学染色法检测巨噬细胞中NFκB+细胞的密度。结果: 双歧杆菌DNA注射组小鼠腹腔巨噬细胞中， PKCα和PKCβII的平均荧光强度明显高于对照组（P0.05）。双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞中， NFκB+细胞的密度显著高于对照组（P
[关键词]双歧杆菌DNA; 巨噬细胞; 蛋白激酶C; 核因子κB
双歧杆菌是人体和动物肠道内数量最多的生理性厌氧菌， 能调节肠道的微生态平衡， 也有抗肿瘤、 抗感染和免疫激活等多种重要的功能[1]。目前研究发现， 双歧杆菌的DNA中含有非甲基化的胞嘧啶磷酸鸟嘌呤基序(cytidinephosphateguanosine， CpG DNA)， 可作为免疫刺激序列(immunostimulatory sequence)激活树突状细胞(DC)， 上调其表面分子和共刺激分子(如CD69、 MHCI、 MHCII类分子、 CD80以及CD86等)的表达。同时， 其还能激活NK细胞和B细胞， 使之产生较多量的IFNγ和抗体[2]。此外，其亦可激活巨噬细胞， 增强其吞噬和细胞毒作用， 并分泌较多量的IL1及IL6， 但其具体的作用机制目前仍不清楚[3]。本研究中应用激光共聚焦显微镜和免疫细胞化学染色法， 检测了青春型双歧杆菌的DNA对小鼠腹腔巨噬细胞中PKC和NFκB的影响， 旨在探讨其激活巨噬细胞的信号途径。
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c小鼠， 6~8周龄， 雌雄各半， 体质量为18~23 g， 购于南方医科大学实验动物中心。兔抗鼠PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ， 购自New England Biolab公司。FITC标记的羊抗兔IgG、 兔抗p65抗体和生物素化的羊抗兔IgG， 均购自北京中山生物技术有限公司。溶菌酶和LPS为Sigma公司产品。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌种来源及其培养 双歧杆菌由本室从健康婴儿粪便中分离培养获得， 经API20A及TAB系统和多次生化反应鉴定为青春型。实验时， 将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中， 置厌氧培养箱， 于37℃培养72 h。将含菌培养液以3000 r/min离心10 min， 去上清， 沉渣以PBS液洗3次， 并调整细菌数为1×1013/L。
1.2.2 双歧杆菌DNA的制备和鉴定 将双歧杆菌接种于硫乙醇酸盐肉汤中， 置厌氧培养箱中于37℃培养72 h。收集细菌， 加入溶菌酶（1 g/L）与SDS（终浓度为10 g/L）裂解菌体后， 用饱和酚抽提去除菌体蛋白并透析。用紫外分光光度计测定所提取的双歧杆菌基因组DNA的A260/A280为1.976。测定DNA的浓度后， 经薄板层析证实，所制备的双歧杆菌DNA中无脂多糖存在， 冷冻干燥后备用[4]。
1.2.3 实验分组及双歧杆菌DNA的处理 实验动物分为两组， 即(1)双歧杆菌DNA注射组: 20只小鼠， 于实验的第1天向小鼠腹腔注射100 g/L硫乙醇酸盐肉汤2 mL， 第2天起腹腔注射双歧杆菌DNA 0.2 μg， 每天1次， 连续5 d。 (2)对照组: 动物的数量及第1天的处理措施均同双歧杆菌DNA注射组， 不同之处为第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 mL， 每天1次， 连续5 d。
1.2.4 巨噬细胞的收集及培养 于实验的第7天， 常规消毒小鼠腹部的皮肤， 以冷的Hank’s液灌洗腹腔。洗出液以1000 r/min离心10 min， 去上清， 沉渣以无血清的RPMI1640培养液重悬2次， 并调整细胞数为1×109/L。吸取100 μL细胞悬液加至孔底铺有盖玻片的24孔细胞培养板中， 置37℃、 50 mL/L CO2 孵箱中培养2 h。弃去未贴壁的细胞， 即得巨噬细胞。再加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液及LPS(终浓度为10 μg/L)， 500 μL/孔， 继续诱导培养24 h。
1.2.5 巨噬细胞PKC含量的检测 通过激光共聚焦显微镜观察PKC的荧光强度反映PKC的含量。具体操作步骤为: ①倾去培养孔内的培养液， 取出爬有巨噬细胞的盖玻片， 滴加3 mL/L H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性; ②以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ③滴加100 g/L非特异性牛血清白蛋白， 室温孵育10 min; ④以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ⑤分别滴加兔抗鼠PKCα、 抗PKCβI、 抗PKCβII、 抗PKCγ、 抗PKCε和抗PKCζ抗体各100 μL， 工作浓度均为1∶200， 于37℃温育60 min; ⑥以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ⑦滴加1∶100 FITC标记的羊抗兔IgG100 μL， 于37℃温育30 min; ⑧以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液充分洗涤5次×5 min; ⑨用激光共聚焦显微镜逐个观察巨噬细胞中的荧光强度。所用激发波长为488 nm， 发射波长为475 nm， 每孔于不同视野计数100个细胞以上， 取其平均荧光值作为定量参数。
1.2.6 NFκB的免疫细胞化学染色 取出细胞培养板孔内爬有巨噬细胞的盖玻片， 以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次， 干燥。染色程序按免疫细胞化学SP法常规进行。一抗为兔抗p65抗体， 二抗为生物素化的羊抗兔IgG。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.7 观察指标及统计学处理 对每张盖玻片以16D目镜测微网在400倍放大下计数网格中细胞核着色的阳性细胞数， 每例计数10个网格， 取其均值作为该样本中NFκB+细胞的密度， 以t检验行统计学处理。其余各组间的比较也采用t检验。
2 结果
2.1 巨噬细胞中6种PKC含量的检测 以激光共聚焦显微镜观测巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的荧光强度。结果显示， 小鼠腹腔巨噬细胞被青春型双歧杆菌的DNA刺激后， 其PKCα和PKCβII的荧光强度明显高于对照组（P0.05， 表1、 图1）。
表1 巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε及PKCζ含量的检测 略
图1 小鼠腹腔巨噬细胞中PKCα表达的激光扫描共聚焦显微镜观测 略
2.2 双歧杆菌DNA对巨噬细胞中NFκB表达的影响 NFκB主要是由p50和p65组成的异源二聚体。实验用兔抗p65抗体作为免疫细胞化学染色中的一抗， 其结果即可反映NFκB的存在。实验结果中， NFκB阳性产物表现为黄褐色颗粒状物。双歧杆菌的DNA注射组巨噬细胞中， NFκB阳性产物存在于胞浆和胞核， 但以胞核为主， 其胞核上NFκB阳性产物的密度为（17563±1020）个; 对照组巨噬细胞中NFκB的阳性产物主要位于胞浆， 其胞核上NFκB阳性产物的密度为（8398±764）个， 两组比较差异具有统计学意义(P
3 讨论
PKC是结构相近、 依赖钙、 磷脂和二酰基甘油激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的多基因超家族，对细胞生长和转化的调节起重要作用。目前已阐明， 很多巨噬细胞的激活剂均能使其胞内PKC的浓度上升。Lin等[5]证实， UTP可激活小鼠RAW264.7巨噬细胞， 提高磷脂酶A2及花生四烯酸的水平依赖的磷酯酰胆碱磷脂酶 C（PIPLC）的活化以及胞内[Ca2+]i浓度的升高， 并证实 PKC的激活亦参与了这一过程。Kumar等[6]报道， 催乳素能激活小鼠腹腔巨噬细胞，使之分泌大量的IL1和NO， 其机制主要是激活PKC。Shishodia和Um等[7， 8]则分别报道， 顺铂和II 型肺炎链球菌细胞壁多糖能激活巨噬细胞， 产生多量的TNFα， 这一过程需要PKC的活化。本研究表明， 双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞中PKCα和PKCβII的荧光强度明显高于对照组; 而PKCβI、 PKCγ、 PKCε及PKCζ的荧光强度在两组间无统计学意义， 提示青春型双歧杆菌的DNA能活化巨噬细胞中的PKCα和PKCβII; 而对PKCβI、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的活性无明显影响。静息状态下， NFκB的同源或异源二聚体与抑制性蛋白IκB结合而存在于胞质中。当细胞受到外界刺激时， 可通过信号转导激活IκB激酶（IKK）， 导致IκB发生磷酸并被降解， 于是NFκB释放出来并被激活， 接着发生核易位， 和靶基因的特定位点相结合， 从而调控靶基因的转录。已知NFκB的活化是巨噬细胞的激活机制之一。von Knethen等[9]发现， 亚致死量的H2O2 能活化小鼠 RAW264.7巨噬细胞中的NFκB， 进而增强环氧合酶 2 的表达。Darieva等[10]证实， BCG能激活小鼠J774巨噬细胞， 使之分泌多量的IL6、 NO 和TNFα等具有杀瘤活性的效应分子， 其机制主要是增强NFκB DNA的结合。Liu等[11]报道， 乳酸杆菌细胞壁中的肽聚糖（peptidoglycan， PG）可作用于小鼠RAW264.7巨噬细胞的Tolllike 受体2(Tolllike receptor 2， TLR 2)， 进而激活NFκB， 最终增强其细胞毒活性。Mandrika等[12]也发现， 具有抗炎和免疫调节作用的黑色素细胞刺激激素α(alphamelanocytestimulating hormone， αMSH)能促使巨噬细胞中的NFκB核转位， 进而上调诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达， 最终催化底物精氨酸产生多量的NO。李义军等[13]则证实， 细菌内毒素能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞NFκB的活性。本研究表明， 双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞细胞核表达NFκB+细胞的密度显著高于对照组， 提示青春型双歧杆菌的DNA能有效地促进巨噬细胞中NFκB的转位和活化。已知双歧杆菌的DNA能激活机体免疫系统中的巨噬细胞。宋文刚等[14]报道， 婴儿型双歧杆菌的DNA能活化巨噬细胞， 增强其吞噬功能， 并使之分泌多量的IL1和TNFα。Stacey等[15]证实， 分叉双歧杆菌的DNA能刺激巨噬细胞释放多量的IL6和 IL12。目前认为， 细菌DNA激活巨噬细胞的途径主要为刺激性CpG DNA与巨噬细胞Toll 样受体9(Toll like receptor 9， TLR 9)的结合， 接着诱导细胞内产生多量的活性氧(ROS)。ROS作为第二信使， 进一步可活化MAPK和AP1等信号分子， 最终调节相关基因的表达[16]。结合本研究的结果， 我们认为， 活化PKCα、 PKCβII及 NFκB是青春型双歧杆菌DNA激活巨噬细胞的另一途径。
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巨噬细胞范文第4篇
泸州医学院附属医院整形烧伤科，四川泸州646000
[摘要] 中性粒细胞、巨噬细胞在整个烧伤免疫过程中起者重要作用。所以弄清严重烧伤后中性粒细胞、巨噬细胞的功能变化及其所带来的影响对预防烧伤后并发脓毒血症、多器官功能衰竭显得尤为重要。现将严重烧伤后中性粒细胞、巨噬细胞的功能变化及其影响作一综述。
关键词 烧伤；中性粒细胞；巨噬细胞
[中图分类号] R644.02[文献标识码] A[文章编号] 1674-0742（2014）04（b）－0195-02
[作者简介]赖晓敏（1987.7-），男，四川人，硕士， 主要从实整形烧伤工作。
严重烧伤后并发脓毒血症、多器官功能衰竭是目前烧伤重要的死亡原因之一，其病情发展快，死亡率极高。是目前烧伤治疗所面临的一个巨大挑战[1-3]。究其本质是有炎症因子所介导的全身炎症反应综合征（SIRS）。而中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMN）、巨噬细胞（Macrophages，m）在整个过程中起着重要作用。所以弄清严重烧伤后PMN、巨噬细胞的功能变化及其所带来的影响对预防烧伤后并发脓毒血症、多器官功能衰竭显得尤为重要。现将严重烧伤后PMN、巨噬细胞的功能变化及其影响作一综述。
1中性粒细胞的生理特点和功能
PMN是外周血含量最多的白细胞，具有变形、游走、趋化、吞噬和分泌等特性。①PMN能伸出伪足做变形运动，通过这种运动，PMN得以穿过毛细血管壁。②渗出到血管外的PMN可以借助变形运动在组织内游走。③在趋化因子的作用下PMN可以朝向某些特定的化学物质运动。这些趋化因子包括两大类：外源性趋化因子和内源性趋化因子。外源性趋化因子包括：可溶性细菌产物（含有N-甲酰基蛋氨酸末端的多肽）。内源性趋化因子包括：补体成分（如C5a）、白三烯、细胞因子（IL18）等。④PMN到达炎症病灶后，通过其细胞质内的嗜天青颗粒和特异性颗粒所含有的水解酶、中性蛋白酶、MPO、阳离子蛋白、溶酶菌乳贴蛋白及碱性磷酸酶将细菌杀灭。⑤PMN在趋化、吞噬过程中还可释放溶酶体酶、活性氧自由基、前列腺素，白三烯等损伤内皮细胞和组织，加重原有的损伤。
2巨噬细胞的生理特点和功能
巨噬细胞是由未发育成熟的单核细胞迁入组织中继续发育而成的具有吞噬和免疫功能的细胞。其细胞体积较大，可达60~80 μm，溶酶体颗粒和线粒体数目增多。因此，巨噬细胞的吞噬能力强，可吞噬更多更大的细菌和颗粒。①免疫功能：巨噬细胞能合成和释放多种细胞因子，包括CSF、白细胞介素（IL-1、IL-3、IL-6、IL-18），肿瘤坏死因子、干扰素等。有研究表明，巨噬细胞可提高HLADR-CD86 等抗原提呈分子的表达，释放单核细胞趋化因子MCP-1，TNF -a等多种炎症因子，诱导和活化其他炎性细胞，在炎症反应中起着重要作用[4]。②吞噬功能：能够吞噬病原体和坏死细胞，有助于启动康复过程。巨噬细胞吞噬病原体和坏死细胞的过程包括识别、吞入、杀伤和降解。巨噬细胞通过细胞表面的非特异性受体吞噬病原菌和坏死细胞。巨噬细胞是通过介导吞噬的相关受体与微生物表面接触，从而启动复杂的信号通道，通过细胞骨架的重排和膜的输送介导对微生物细胞吞噬效应[5-6]。当病原菌进入吞噬溶酶体后可被依赖和非依赖氧途径杀伤和降解。
3严重烧伤后中性粒细胞功能的变化及其影响
PMN在整个炎症反应发生过程中起着重要作用，严重烧伤后PMN不仅可以穿过血管壁聚集到损伤区域， 吞噬异物、杀灭细菌[7]，还可直接释放炎症介质，且与内皮细胞黏附后可造成自身组织损伤[8]。①严重烧伤后PMN延迟凋亡。有研究表明[9-12]，严重烧伤后PMN的凋亡发生延迟，而延迟凋亡的PMN可发生继发性坏死，释放大量炎性物质，导致炎症反应的扩大，促发全身炎症反应综合征（SIRS），导致局部和全身的组织损伤甚至脏器的损伤。②PMN的趋化功能改变。PMN趋化因子包括：病原菌、补体C3a、C5a、C、纤维蛋白降解产物、纤维肽B和血管舒缓素等。严重烧伤后，PMN的趋化性立即增加，主要是因为不耐热刺激活动的增加，然后其趋化性逐渐减弱。而PMN趋化性减弱的时间出现越早，其持续时间将越长。有研究表明[13]烧伤后创面应用磺胺嘧啶银的患者，其血清对正常人PMN的趋化性有抑制作用。实验证明，IL-18能够促进PMN的趋化作用[14]。腹腔注射IL-18后，能够增加肠道PMN的浸润，导致肠道组织水肿[15]。③严重烧伤后PMN的吞噬功能明显下降，早期吞噬细胞的吞噬指数和吞噬细胞百分率下降，一周左右恢复。有文献报道[16]大鼠5Gy60Coγ射线全身照射复合15%TBSAⅢ度光辐射烧伤后，PMN的吞噬功能明显降低。④中性粒细胞的杀菌功能改变。当病原菌被PMN吞噬后，主要通过氧依赖过程和氧不依赖过程进行细胞内杀灭细菌。有实验证明[17]烧伤后各种因素均可激活中性粒细胞，如坏死组织、缺血、缺氧、炎症介质和细胞因子等。不但可使PMN生成增加，也使外周血中成熟的PMN游出血管，PMN到达创伤部位可释放出氧自由基、蛋白水解酶等起着杀菌作用，同时也造成组织新的损伤，表现为创面的加深和扩大。
4严重烧伤后巨噬细胞功能的变化及其影响
人体具有免疫功能的细胞主要包括嗜PMN、单核巨噬细胞和淋巴细胞等。其数量和功能与感染密切相关，而在这些免疫细胞中，M发挥着极其重要的作用。烧伤后巨噬细胞活化，分泌能力增强， 大量释放炎症介质，是引起全身炎症反应综合征的原因之一。（1）烧伤后部分巨噬细胞的表型可发生改变。有实验证明：①烧伤后巨噬细胞产生一氧化氮的量增加。Schwacha等[18]证明，烫伤小鼠的脾脏巨噬细胞诱导型一氧化氮合成酶活性增加。②巨噬细胞产生PGE2的量呈明显增加[19]。③烫伤小鼠脾脏巨噬细胞中诱导型环氧化酶2（COX-2）的活性增加[20]。④烧伤后巨噬细胞产生IL-10的量增加。以上均提示烫伤引起了巨噬细胞表型的变化。（2）严重烧伤后M的免疫功能改变：研究表明[21]，烧伤后巨噬细胞被激活，巨噬细胞实现抗原提呈功能的人白细胞DR抗原的表达率明显下降，下降的程度及所持续的时间与烧伤严重程度有关。目前认为：当DR抗原表达率不足30%时，可认为单核细胞免疫麻痹[22]。（3）烧伤后巨噬细胞的吞噬能力增强：实验证明[23]：兔角膜碱烧伤后，腹腔巨噬细胞的体积明显增大，吞噬能力显著增强。在烧伤后9周内，其对异物性细胞的吞噬率及吞噬指数明显高于烧伤前。
5结论
以上研究表明烧伤后PMN、巨噬细胞的功能发生了一系列复杂的变化，其在全身炎症反应综合征，烧伤后并发脓毒血症，多器官功能衰竭中都起着重要作用。弄清其功能的变化及其所带来的影响对预防烧伤后并发脓毒血症、多器官功能衰竭尤为重要。但目前尚缺乏有效控制或恢复烧伤后PMN、巨噬细胞功能的药物或技术手段。一些功能改变的机制尚待进一步研究。
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巨噬细胞范文第5篇
【关键词】 免疫性血小板减少性紫癜 二氯亚甲基二膦酸盐 明胶微粒 巨噬细胞
experimental study for thrombocytopenic purpura therapy by targeting macrophages in liver and spleen
tan zhonghua, li peiyong, zhu yihua1, ji xiaowen, wu zhenyu
department of nuclear medicine, ruijin hospital, the shanghai jiaotong university, shanghai 200025, china; key laboratory, division of education on preparation and application of superfine materials, huadong university of science and engineering, shanghai 200237, china
abstract the study purpose was to explore whether dichloromethylene diphosphonate (cl2mdp)loaded gelatin particles can induce the depletion of macrophage in reticuloendothelial system of liver and spleen or can depress the immunity of macrophage in sd rat models of immune thrombocytopenic purpura (itp) to treat the itp rats. new zealand rabbits were immunized with platelets of sd rats to prepare rabbit antirat platelet serum, and the serum was intravenously injected into sd rats to produce the itp model. in experimental itp models, 150 μl of antiplatelet serum was intravenously injected into sd rats per 24 hours. the platelet counts maintained pathological level and were persistently less than 50×109/l in the models during experiment process. the mtt test of macrophage raw264.7 was carried out by means of cl2mdploaded gelatin particles in vitro. after intravenous injection of a group dose of cl2mdpgelatin particles, the platelet counts of the rats were measured at the time of 4 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours, respectively, and bleeding times were detected in 24 hours. the results showed that cl2mdploaded gelatin particles increased the platelet counts of itp models to mean of 180×109/l, a physiological level in 24 hours after injection, and kept this platelet level through whole process of 120 hours. furthermore, rats pretreated with cl2mdploaded gelatin particles avoided the decrease of platelet counts significantly when they were injected antiplatelet serum. it is concluded that cl2mdploaded gelatin particles restrain multiplication of macrophage raw264.7, and promptly, effectively restore platelet counts of itp models to physiological level in a dose dependent manner. so, the targeting therapy of drugloaded gelatin particles offers a new idea and approach to treat itp, and this strategy is worthy of further studies.
key words immune thrombocytopenic purpura; dichloromethylene diphosphonate; gelatin particle; macrophage; targeting therapy
j exp hematol 2007; 15(1):103-107
免疫性（原发性）血小板减少性紫癜（itp）是一种由抗血小板抗体引起的自身免疫性的出血性疾病，其临床特征为患者自身抗血小板抗体导致的血小板破坏增加而使循环血小板减少，以及由此引起的皮肤、粘膜出血。研究表明，itp患者血小板的破坏发生在网状内皮系统，尤其是在肝脾的巨噬细胞中［1］。目前itp的临床常规治疗方案，如糖皮质激素、脾切除、免疫抑制剂、达那唑和大剂量γ球蛋白等治疗的缓解率不理想且易复发，毒副作用较大，而在治疗无效和缓解后复发的患者中不少人存在发生致命出血的危险［2，3］。一些研究人员和临床医师对美国血液学会制订的itp诊断与治疗指南［4］，存有异议［5］。这表明对itp的治疗仍未完全解决，探索其有效的治疗手段有着重要的现实意义。本实验在我们已经研究制备的cl2mdp明胶微粒基础上［6］，进行巨噬细胞株raw264.7的mtt试验及治疗sd大鼠itp的初步实验研究，结果令人满意。
主要试剂
明胶微粒（粒径300-500 nm、表面带8.9 mv正电荷的zeta电位）由华东理工大学超细材料制备与应用教育部重点实验室制备；二氯亚甲基二瞵酸盐（cl2mdp，sigma公司产品），四甲基偶氮唑盐（mtt，sigma公司产品），dmso（sigma公司产品），dmem（gibco公司产品），胰酶edta（gibco公司产品），青霉素、链霉素（gibco公司产品），胎牛血清（fcs，gibco公司产品）；其余所用试剂均为国产，分析纯。
细胞株和实验动物
raw264.7巨噬细胞株为中国科学院上海细胞生物所保存株。sd大鼠、新西兰大白兔购自上海第二医科大学附属瑞金医院动物房。
cl2mdp明胶微粒的制备［6］
明胶微粒对药物的包封、肝脾靶向性和生物相容性研究在我科实验室进行，载药（cl2mdp）量为5 mg/mg明胶微粒。
巨噬细胞的mtt试验
细胞培养 巨噬细胞株raw264.7常规复苏后以含10% fcs的dmem培养液于37℃、5% co2中孵育24小时。移去培养液及未贴壁细胞，再加入培养液继续孵育至细胞长满培养皿底。以0.25%胰酶+edta消化30秒，制成细胞悬液传代，至细胞长满培养皿底后再次制成细胞悬液进行mtt试验。
mtt试验 ①铺板：在24孔培养板中加入细胞悬液，使实际铺板细胞数为每孔106个。于37℃、5% co2孵育24小时使巨噬细胞贴壁。②干预：将原培养液吸净，分别加入含10% fcs 的dmem 和不同剂量的cl2mdp明胶微粒、cl2mdp，各为0、0.02、0.04、0.06、0.08及0.1 mg（以所含cl2mdp计）5个剂量组，明胶微粒组则加入含10% fcs 的dmem 和0.1 mg明胶微粒，对照组只加入含10% fcs 的dmem。以上共12组，于37℃、5% co2孵育24小时。③加mtt：将每孔中的培养液吸净，加入新鲜配制的mtt溶液（2 mg/ml）250 μl，在37℃、5% co2条件下继续孵育4小时。④显色：将培养板倒置在滤纸上，轻拍板底，使其中mtt溶液尽可能流出。然后每孔加入dmso 750 μl，摇匀后室温放置15分钟。然后将每个培养孔中的液体吸出50 μl加入96孔板，每个干预因素加6孔。⑤测值：用酶标仪以570 nm测每孔溶液的od值，按公式计算细胞抑制率。实验结果取6孔平均值。
细胞抑制率=（对照组od值-干预因素组od值）/
对照组od值×100%。
兔抗鼠血小板血清的制备
分离血小板 sd大鼠乙醚麻醉，腹主动脉取血，全血与抗凝剂（3.8%柠檬酸钠）之比为9∶1。室温， 125×g离心10分钟，无菌下移取上层富血小板血浆2 000×g离心20分钟，移除上层血浆；沉淀的血小板以0.05 mol/l ph 7.4的pbs洗涤2次，生理盐水悬浮，取少许稀释后计数。
免疫 用sd大鼠血小板耳缘静脉注射免疫新西兰大白兔，每只约1×109个血小板，分别在首次免疫后的第15、30、40天时重复免疫1次。
提取抗血小板血清 末次免疫后10天，5%巴比妥麻醉，颈动脉插管（预先以肝素湿润管壁）取血。兔的全血于室温下放置1小时后移至4℃冰箱过夜，然后4℃、2 000×g离心20分钟，然后于无菌条件下移取上层血清分装，-20℃冻存备用。
itp模型的建立［7，8］
为了避免所使用的igg聚合引起局部阻塞，采用未经处理的兔抗鼠血小板血清代替纯化抗体建立itp模型。
单次不同剂量注射 抗血小板血清50、100、150、200、300 μl，以sd大鼠血清稀释至500 μl后静脉注射，每组5只，另取5只静脉注射普通兔血清500 μl为对照。分别于注射前（0小时）、注射后4、24、48、72、96小时取血进行血小板、白细胞和红细胞计数。
多次同一剂量注射 鉴于150 μl组的血小板计数于静脉注射后4小时降至最低为（38.8±4.8）×109/l（图1），且不至引起实验动物死亡。取sd大鼠5只，每24小时重复静脉注射抗血小板血清150 μl，在相同的时间点取血进行血小板计数。
出血时间测定 抗血小板血清注射后24小时在sd大鼠的尾巴上，用无菌刀片切出深约3 mm与尾静脉平行的创口（注意避开能目击的静脉），每隔30秒用滤纸吸去出血直到出血完全停止，记录这期间的时间。
cl2mdp明胶微粒对itp模型的实验性治疗
不同剂量cl2mdp明胶微粒对itp动物模型的疗效 按多次同一剂量（150 μl）注射方法制备itp动物模型。首次注射抗血小板血清4小时后取血进行血小板计数（0小时），再静脉注射不同剂量的cl2mdp明胶微粒（所含cl2mdp分别为2、4、6、8 mg），每组5只。于cl2mdp明胶微粒注射后24、48、72、96、120小时取血进行血小板计数。
cl2mdp明胶微粒抑制抗血小板血清的作用 同上方法制备itp动物模型。首次注射抗血小板血清4小时后取血进行血小板计数（0小时），分别注射cl2mdp明胶微粒（含cl2mdp 8 mg）、明胶微粒（2 mg）、cl2mdp（8 mg），每组5只；另取5只sd大鼠先注射cl2mdp明胶微粒（含cl2mdp 8 mg），24小时后进行血小板计数（0小时），再静脉注射抗血小板血清150 μl，并每24小时重复1次。
上述各组分别在首次计数后24、48、72、96小时取血进行血小板计数，并在24小时按前述方法测定出血时间。
统计学处理
采用sas 6.12统计软件，血小板计数以±sd表示，进行t检验。
结 果
mtt试验
raw264.7巨噬细胞的mtt试验结果见附表。结果显示，cl2mdp明胶微粒组的巨噬细胞增殖抑制率显著高于其它两组（p<0.01），且其组内各剂量间的mtt试验结果也有明显差异（p<0.05），表明cl2mdp明胶微粒可以剂量依赖的方式抑制巨噬细胞株raw264.7的增殖。
sd大鼠itp模型
单次不同剂量注射 sd大鼠静脉注射抗血小板血清后血小板计数的变化见图1。在50、100、150 μl剂量组，注射后4小时血小板计数逐渐下降至最低，分别为（92.5±7）×109/l、（61.7±8.3）×109/l、（38.8±4.8）×109/l，其后逐渐上升，至48小时恢复正常水平。对照组的血小板计数未见明显变化，各组红细胞和白细胞计数均未见明显异常变化。
此外，200 μl组中于注射抗血小板血清后4小时内有2只动物死亡，存活的3只鼠4小时血小板计数为（14.8±2.9）×109/l，300 μl组动物全部死亡。解剖发现死亡鼠的内脏如肝、脾、肺及心包等存在程度不等的出血点或出血。
figure 1. platelet counts after single intravenous injection with different dose of antiplatelet serum in sd rats.
多次同一剂量注射 150 μl抗血小板血清每24小时重复静脉注射后血小板计数的变化见图2。图中对照组和单剂量组引用图1中数据。结果显示每24小时重复静脉注射1次150 μl抗血清，能够使sd大鼠的血小板计数维持在低于50×109/l的病理水平（与对照组比较，p<0.01）。
figure 2. platelet counts after multiple intravenous injection with the same dose of antiplatelet serum in sd rats.
出血时间 对照组sd大鼠的出血时间均<2分钟（n=5），而实验组的出血时间均>3分钟（n=15），显示由抗血小板血清静脉注射引起血小板下降后，也相应的导致出血时间明显延长（p<0.01）。
cl2mdp明胶微粒对鼠itp模型的实验性治疗
cl2mdp明胶微粒对itp模型的疗效 各组剂量cl2mdp明胶微粒治疗后血小板计数的变化见图3。由图3可见，不同剂量的cl2mdp明胶微粒能使sd大鼠的血小板计数迅速得到恢复，其恢复的程度和持续时间与注射的剂量有关。8 mg剂量组的疗效较佳，血小板恢复到平均180×109/l左右，在实验期间能维持在正常范围，未出现再次明显下降。
figure 3. platelet counts after treatment with different dose of cl2mdpgelatin particles in itp models.cl2mdp明胶微粒对抗血小板血清作用的影响 各组sd大鼠在不同时间点的血小板计数见图4。由图4可见，单纯明胶微粒或cl2mdp对模型不产生治疗作用，其血小板计数在实验期间未见明显变化，而预先注射cl2mdp明胶微粒可避免注射抗血小板血清引起的血小板下降。
figure 4. cl2mdpgelatin particles avoid the effect of antiplatelet serum.ab:antiplatelet serum.
出血时间 在ab+明胶微粒组和ab+cl2mdp组，出血时间均>4分钟；在ab+cl2mdp明胶微粒组和cl2mdp明胶微粒+ab组则均<2分钟，两者间比较有显著差异（p<0.01）。
讨 论
治疗itp的靶向药物输送方法早在1978年已有报道［9］，ahn等［9］使用载有长春碱的血小板作为巨噬细胞的“特洛伊木马”，希望药物进入细胞后再释放出来杀死巨噬细胞，但其研究未达预期目的。直到有研究者发展了一种被称为巨噬细胞“自杀”技术的研究方法［10］，这一itp的治疗策略才重新引起了人们的关注。这种方法现已成为研究生理或病理状态下巨噬细胞功能的常用手段，并开始研究用于治疗一些以巨噬细胞为药物作用靶点的疾病（如itp、aids等）。
建立动物itp模型的方法主要有3类，化学药物诱导、使用抗血小板抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）制备或使用有自发发生自身免疫性疾病倾向的动物种系［7，8，11，12］。本实验使用抗血小板抗体建立sd大鼠itp模型，单次注射一定剂量的抗体所导致的血小板减少仅持续不到24小时，至48小时已恢复正常水平。而通过每24小时重复注射150 μl抗血小板血清，能够维持血小板计数持续<50×109/l，出血时间延长到>4分钟（正常<2分钟），而红细胞和白血胞计数未见明显降低，符合itp的实验室检查表现，这表明模型的建立是成功的。但临床上除儿童itp多表现为急性外，成人itp大多起病缓慢，而通过注射抗体建立模型从病理上看应属一种急性的疾病发生过程，因此这种动物模型能否反映成人itp的病理特征尚需进一步研究。
在sd大鼠itp模型的治疗中发现，血小板计数在用药后恢复的程度和持续时间与所使用的药物剂量有关，呈剂量依赖关系，这一结果与巨噬细胞株raw264.7的mtt试验结果相符。cl2mdp明胶微粒注射后24小时就可使模型的外周血小板数量迅速恢复到不致发生出血的正常水平，出血时间也随之缩短，而明胶微粒和cl2mdp单独使用则没有这种作用。此外，预先使用cl2mdp明胶微粒处理实验鼠能避免抗血小板血清引起的血小板降低及出血时间延长，防止发生抗血小板抗体诱导的itp。我们先前已对明胶微粒的肝脾靶向性进行了研究［6］，结果表明，cl2mdp明胶微粒进入sd大鼠体内主要被肝脾巨噬细胞摄取清除，其余脏器除肺、肾有少量聚集外基本没有载药微粒分布。结合本实验结果表明cl2mdp明胶微粒能够抑制肝脾巨噬细胞清除被抗血小板抗体激活的血小板，因此尽管每24小时重复注射抗血小板血清，但实验期间血小板计数不会再次下降。
cl2mdp是临床上治疗骨质疏松和肿瘤骨转移的常用药物，为水溶性，难以通过细胞膜，将其与300-500 nm的明胶微粒连接，则可通过肝脾巨噬细胞对明胶微粒的摄取而进入细胞内发挥治疗作用。目前药物的杀伤细胞或抑制细胞活性的机制尚未完全清楚，但现有研究已证实此药对吞噬细胞（巨噬细胞、破骨细胞等）有毒性作用［13］。在以脂质体为载体进行的靶向巨噬细胞的动物研究中，研究者认为它的作用机理是：抑制或干扰细胞的物质代谢（如溶酶体酶等的合成）与能量代谢（形成不能水解的atp类似物）；影响单核吞噬细胞分泌细胞因子的种类和量，抑制干细胞的分化和成熟细胞的功能；在体外可诱导肿瘤细胞（骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌等）和巨噬细胞凋亡等［14］。但本实验中cl2mdp产生疗效的确切机制及其对全身免疫功能的影响还有待明确。
我们的实验结果和文献资料［7，8］均表明，使用明胶微粒作为cl2mdp的载体将其定向输送到肝脾巨噬细胞治疗itp是可行的，尤其对急性发作所致血小板迅速下降可能导致的出血有较好的治疗与预防作用，同时还可避免常规治疗中伴随的药物毒副作用较大的缺点。尽管目前的资料尚不能表明这种靶向治疗的方法能够有效地解决itp临床常规治疗方案容易复发的难题，其药代动力学和确切的治疗机制也有待阐明，但作为有良好应用前景的itp治疗的研究方向值得重视。
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