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细胞技术范文精选

细胞技术

细胞技术范文第1篇

1、挑选本院2010年6月至2012年12月送检病理科支气管镜刷检细胞学标本252例。所有的患者最后均确诊为肺癌。男184例,女68例,年龄44~85岁,(平均66.3岁)。所有的患者行支气管镜刷检,同时薄层液基细胞学涂片与传统涂片。

2、仪器:美国SurPathTMPrepstain全自动液基薄层细胞制片染片机(BDTriPath,BurlingtonNC,USA)及相关耗材。采用奥林巴斯电子支气管镜(BF-260或1T260工作镜)进行检查。镜下发现肺癌的直接征象或间接征象者,根据胸部CT提示的病变行透视下支气管镜肺活检。所有患者均在活检部位采用南京微创一次性保护型细胞刷刷检,将毛刷头直接在玻片上常规涂片1张。再将毛刷头置于盛有10mlCyteRichRed固定液的50ml离心管中充分震荡漂洗收集细胞。

3、制片方法

3.1传统涂片方法:纤维支气管镜刷头直接涂抹于载玻片上,涂片1张,干燥,95%乙醇固定10min,常规HE染色镜检。

3.2BDTriPath制片方法:标本加入专用50ml离心管中,使用程控离心机以Hettich3#程序600r/min离心10min,迅速管架倒置180°倾出上清液,加入CyteRichRed固定液20ml,静置30min,Hettich的3#程序以600r/min离心10min,迅速管架倒置180°倾出上清液,涡漩混合器振荡均匀,加入10mlTris缓冲液,混均,移至12ml的离心管,Hettich的4#程序以600r/min离心5min,迅速管架倒置180°倾出上清液,涡漩混合器振荡(15±5)s。管架放在PrePStain系统上,静置10min,等待上机自动制片染色。

4、判断标准:涂片诊断采用正常、可疑癌细胞、癌细胞三种分类方法,后两项为阳性标本。尽量由同一位医师操作电子支气管镜采集标本,由两位细胞病理学医师同时阅片镜检,以找到癌细胞为阳性。

5、统计学方法:统计学处理数据采用SPSS10.0软件包进行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

两种涂片质量比较:传统涂片,涂片范围大小不一,涂片背景红细胞白细胞多,细胞分布厚薄不均,胞质核浆结构对比不明显,胞核染色质均一模糊、核仁不清;支气管镜刷检细胞标本LCT制片后,细胞集中于涂片范围直径15mm专用玻片上,细胞界限清楚,涂片背景干净清晰,细胞分布单个散在或成团分布,有立体感,胞质着色鲜艳、易于观察,胞核核膜分明,核内染色质及核仁清晰可见。薄层液基细胞学涂片诊断肺癌阳性率为58.33%,(146/252),其中中央型肺癌98例,周围型肺癌48例。传统涂片诊断肺癌的阳率为33.19%,(84/252),其中中央型肺癌68例,周围型肺癌16例。液基薄层细胞学与传统涂片的阳性率的差异有统计学意义P<0.05。

三、讨论

支气管镜刷检细胞学标本应用传统涂片方法制片,受细胞新鲜程度、细胞量、出血及炎性背景、制片技术等因素影响,造成背景不清晰、涂片细胞易重叠、厚薄不均、细胞形态不易观察、有意义细胞数量偏少,容易出现假阴性或假阳性结果,漏诊重要病变。液基薄层细胞学制片技术(LCT)是近年来出现一种制片技术的革新,明显优于传统巴氏涂片的检查方法,其中有代表性的是BDThiPth离心沉降技术和新柏氏(ThiPthTCT)模式技术。两种方法工作原理不同,分别为重力沉降式和过滤膜式,已经广泛成熟应用于宫颈细胞学检查和TBS诊断报告,对比传统巴氏涂片,宫颈癌及癌前病变(低度鳞状上皮内病变和高度鳞状上皮内病变)检出率大大提高,标本采集及制片质量的优越性是传统涂片技术无法比拟的,特别是BDThiPth制片技术在细胞数量、背景去除非诊断性杂质、全自动制片染色及诊断质量尤为突出。美国FDA认证:超柏式液基薄层细胞学检查是所有液基细胞学技术中检出率最高的技术。2005年美国病理协会非妇科细胞学实验室比较液基制片方法与传统制片方法在体液样本检测能力,证实液基制片方法更容易检出肿瘤。

对比传统涂片,LCT制片使细胞在载玻片上分布均匀,厚薄一致,细胞数量多,集中于15mm范围内易于阅片,核染色质着色鲜明,核浆对比效果好,易于观察核结构,染色背景清晰,制片质量十分满意,阳性率显著提高。LCT制片技术和诊断质量体会:支气管镜刷检由于全部收集或大部分收集送检标本,最大程度保留病变细胞,尤为适用LCT制片方法;液基涂片中的细胞核可能不如传统涂片中那样深染,但细胞核异型性是判读恶性或可疑恶性病变的重要重要标准,一般认为核占优势、核浆比例高、核膜不规则、染色质凝块状、核仁清或多个小核仁为恶性证据;巴氏染色胞浆在区分腺癌或分化鳞癌很有帮助,前者胞浆见空泡,后者胞浆橘黄色、含角蛋白;仔细观察成团核深染的细胞,如怀疑异常,在背景中全面寻找单个异型细胞更有意义;提高制片质量显著,但诊断阳性率的改善还需病理诊断医师勤于积累,LCT在支气管镜刷检细胞标本应用时间及应用范围还比较晚,对同一份标本同时进行普通涂片,以积累经验,减少误诊。

支气管镜检查是目前诊断肺癌的常规检查方法,刷检联合组织活检的重要手段。传统支气管镜黏膜细胞学检查是在支气管镜检查过程中用支气管毛刷直接在普通玻片上涂片,诊断率低。LCT对肺癌有更高的诊断率。国内也有少量文献报道。本研究结果显示,经过与组织病理学对照,普通涂片法检出敏感度为33.19%,而LCT检出敏感度为58.33%,较普通涂片法提高了25.14%,差异有统计学意义(P<0.05)。

四、总结

细胞技术范文第2篇

1.1金属元素

有研究发现,某些重金属,比如锰的慢性中毒可损害中枢神经系统,特别是纹状体和苍白球等部位,产生类似PD的锥体外系神经功能障碍。Guilarte等及Huang的研究也发现锰中毒与PD有着密切的联系。Park发现电焊工及其他长期暴露于锰的工人存在着出现神经症状和罹患PD的危险性。Moberly等的研究还表明,锰可以通过作用于嗅球和基底神经节的多巴胺能神经元来影响神经介质的释放,从而导致PD等锥体外系疾病的发生。Coon等利用K-XRF技术测量了慢性暴露条件下铅在人体内的沉积量,并表明长期的铅暴露与PD发病风险成正相关。Komatsu等证实了锰、铁、铅、镉、铝等金属在体内的沉积会导致氧化应激的增加,从而引起PD的发生。

1.2农药百草枯

对多巴胺系统具有神经毒性作用,从而导致PD样症状和改变。Betarbet等利用鱼藤酮复制出了类似PD的大鼠模型,其症状包括出现震颤、步态不稳等。某些PD患者的脑组织中所含有机氯农药,如林丹、狄氏剂的水平明显高于对照组。代森锰(一种杀真菌剂)也被报道与PD的发生相关。还有研究发现,有机磷农药同样与PD的发病相关。

1.3环境毒素

1983年,美国有人吸食了含有1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)的海洛因后出现了典型的PD症状和病理学改变,研究者受到启发用灵长类复制了MPTP的PD动物模型。研究人员经过实验证实,MPTP对多巴胺能系统具有神经毒性从而导致PD样症状和改变。此后,MPTP的PD模型开始被应用于试验中。另外,Shepherd等发现,MPTP还可明显增强百草枯对多巴胺能系统的损害。

1.4其他因素

PD的发病还与很多种因素相关。有学者经过研究发现,摄入过多的脂肪,罹患PD的概率也会增加。Miyake等发现摄入花生四烯酸和胆固醇会增加PD的发生概率。Kyrozis等通过对希腊人饮食习惯的研究发现饮用牛奶也和PD发病有关。Kotagal等发现高血压等心血管危险因素与PD发生具有一定相关性。Aryal等还发现,四氢生物蝶呤(BH4)等增加会导致PD初期病情的恶化。Willis等发现居住环境与PD的发生也有一定关系。

2PD发病机制的研究手段及应用进展

2.1概况

当前的PD研究手段包括动物模型,细胞模型和iPScs模型等。动物模型为PD发病机制最早的研究方式。Maneuf等早在20世纪50年代就通过对啮齿类动物注射利血平的方法使其产生类似人类的PD样症状。此后研究者们又相继积极研发出了6-羟多巴胺模型,百草枯模型等。基因敲除和转基因小鼠模型在PD研究中也有应用。细胞模型包括肾上腺嗜铬瘤细胞系(pheochromocytomacells,PC12)细胞模型,SH-SY5Y细胞模型等。大脑结构复杂性的缺乏和较短的模型寿命意味着小鼠等动物模型难以详尽地阐释人类的疾病,细胞模型也并没有可靠地显示出在PD患者身上所观察到的缓慢的疾病进程。近几年,新兴的iPScs技术,将来源于PD病人的iPScs可分化为中脑多巴胺能神经元,在体外模拟其生理特性,可方便研究人员在更接近人体内环境的条件下研究PD的发病机制。

2.2iPScs技术的发展

iPScs技术是干细胞领域近几年来比较热门的一种新兴干细胞技术。该技术通过病毒载体或其他特异载体将特定转录因子的组合转入到被诱导细胞中,进而将已分化的体细胞重编程为未分化的多能细胞。2006年Takahashi成功将小鼠成纤维细胞重编程为与胚胎干细胞特征相似的诱导性胚胎干细胞,即iPScs。他利用逆转录病毒将4个与多能性相关的基因Oct-4、Sox2、Klf4、c-Myc组合导入被诱导细胞,再经过多能性分子Fbxl5筛选,从而得到在多方面与胚胎干细胞很相似的多能性细胞。随后成功诱导出iPScs。2008年Nakagawa研究小组使用了Oct3/4、Sox2、Klf43个基因,避免了原癌基因c-Myc的插入使得iPScs更安全化,利用Nanog代替Fbx15作为筛选标记,从而进一步提高了筛选的特异性。2009年,Woltjen研究小组以转位子为载体代替了逆转录病毒,所得到的iPScs避免了病毒基因的顽固表达和插入突变等风险,从而使得临床应用风险进一步大大降低。另外,直接将重组蛋白质导入体细胞以及利用合成mRNA进行转染等方法也显著降低了突变的危险性。有报道称体细胞可以通过小分子复合物而不依靠病毒来实现重编程。还有研究者发现毛猴素,二甲基五羟色胺和D4476可作为Oct3/4的化学替代品。随着研究的深入,iPScs技术愈加成熟,不断进展的诱导iPScs的方法既可有效消除重编程造成的种种潜在危险,又可以简单快速地获得iPScs。

2.3利用iPScs技术进行环境、职业致病因素

诱导PD发病机制的相关研究由于环境因素和遗传因素相互影响的复杂性,环境职业因素对PD作用相关的研究具有一定难度。Aboud等以无PD遗传危险因素者为对照组,以PARK2等位基因功能缺失且具有PD家族史但是还未出现症状者为实验组建立了观察锰神经毒性差异的iPScs模型。来源于实验组和对照组的真皮成纤维细胞的iPScs被分别诱导分化为早期神经神经前体细胞。经过测定发现两组神经前体细胞在对锰毒性的敏感性和线粒体分裂等方面几乎没有差别,但是实验组与对照组相比,活性氧显著升高。经过测定发现实验组与对照组相比,锰在细胞内的沉积明显减少,表明在锰沉积率相同的条件下实验组神经前体细胞对于锰毒性的敏感性比对照组高。但是锰沉积明显减少的原因是否与PARK2突变有关尚不清楚。Kikuchi等将人体iPScs来源的的神经前体细胞在无血清、无饲养层条件下培养至28d和42d后分别定向性植入MPTP处理过的猴子双侧豆状核,植入6个月后。磁共振成像(MRI)图像显示移植的细胞在猴子的大脑中存活增殖。由于MRI图像与猴子脑片苏木精-伊红染色的结果具有一致性,他们利用MRI来观察移植细胞的增殖情况。培养至28d的移植细胞增殖迅速,而培养至42d的移植细胞增殖相对缓慢。他们还发现移植后1~3个月的细胞倍增时间明显短于3~6个月,说明细胞的增殖能力在后期开始下降,但至少可以在猴脑内存活6个月以上。他们又通过描述行为评定量表发现移植后猴子的行为较之前发生了一些进步,表明人体iPScs在未来临床试验中的治疗潜力。Deleidi等通过逆转录病毒将人类KLF4,SOX2,OCT4和c-MYC导入恒河猴皮肤成纤维细胞,获得iPScs后进一步将其诱导为多巴胺能神经元细胞并植入6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的小鼠PD模型的纹状体,移植细胞在移植16周后进行组织分析发现具有酪氨酸羟化酶阳性细胞,且小鼠的纹状体中显示出神经的再生现象。他们还发现这些动物的同侧旋转行为等在移植后均有所恢复,而且移植6个月后这些小鼠既没有产生肿瘤,也没有发生炎症反应,进一步证实了iPScs在PD等神经退行性疾病在临床治疗方面的安全性。Chang等的研究证实了二十二碳六烯酸处理过的iPScs来源的多巴胺能神经元前体细胞植入到6-OHDA诱导的小鼠PD模型体内,小鼠的症状在4个月后得到了一定的缓解。Peng等将来源于iPScs的神经多巴胺能神经元建立起1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP+)模型和鱼藤酮的PD体外模型,对44种可能对PD有治疗作用的药物进行了两轮筛选,并利用具有神经保护作用的神经营养因子作为阳性对照。经过MPP+的初筛和确认筛检,他们发现其中16种药物对于MPP+诱导的神经细胞死亡显示出神经保护作用,并利用MPP+模型建立起了这16种药物的剂量反应曲线。经过鱼藤酮模型的筛检他们更加明确了这些药物对于鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元凋亡确实具有一定的保护作用。这种方法可以应用于可能具有临床疗效的PD药物的检测来缩短药物进入临床的时间,并可增加临床实验成功的可能性和个体化治疗的可能性,为明确药物疗效提供了良好的平台。

2.4iPScs技术

细胞技术范文第3篇

1实验对象及样品制备本实验对象为半年内未接受过输血的健康中国人12名,抽取静脉血5ml,使用ABO血型检测试剂检测其ABO血型。其中A型血2人,B型血6人,O型血3人,AB型血1人,RhD血型均为阳性。样品制备人员将A、B、O血型相同且测定的8种血型抗原至少有2种不相同的单一血样制备成体外混合血样。混合血样依据红细胞数按一定比例混合,混合比例分别为95%/5%、97%/3%、98.5%/1.5%、99.5%/0.5%,各比例混合血样的例数分别为8例,8例,8例,10例。样品制备人员将所有单一和混合血样编号后发放给检测人员进行检测分析。

2仪器和试剂本实验所用检测仪器为美国BeckmanCoulter公司生产的FC500型号流式细胞仪。使用抗体为瑞士DiaMed公司生产的单克隆抗体产品,以及SEROTEC公司生产的FITC荧光标记的羊抗人免疫球蛋白。

3实验方法用细胞稳定液将EDTA抗凝的新鲜血稀释后,加入单克隆抗体,使之与相应的红细胞表面抗原结合,并用荧光素标记的示踪抗体标记红细胞表面抗原抗体复合物。使用流式细胞仪对红细胞表面特定血型抗原的表达情况进行数据采集和分析。通过对此方法检测的特异性和灵敏度、信噪比和污染携带率、检测样品稳定性和操作稳定性等方面的检测,验证流式细胞仪检测异体血液回输方法的准确性和可操作性。

二、实验结果

1抗原检测特异性和灵敏度经检测,这46例血样的检测判定结果为:12例单一血样全部被检出单峰并被准确判为阴性。8例95%/5%和8例97%/3%比例混合的血样均被检测出两个以上双峰,所有应为混合双峰的样品均被准确检出;8例98.5%/1.5%比例混合的血样在应出现双峰的样品图中能被识别为双峰,但个别抗体双峰分离效果不佳,需进行抗体优化程序后方能被判定为双峰;10例99.5%/0.5%比例混合的血样中,只有4例样品被判断为含2个以上双峰,其他混合样品由于混合比例低于抗体检测限而无法判定。

2仪器信噪比和污染携带率

2.1仪器信噪比以8种抗体在95%/5%混合红细胞样品中只加入荧光示踪抗体时,表达区域的红细胞数占已设定的红细胞区域内细胞总数的百分比作为噪音,以3倍噪音作为该抗体的检测限

2.2污染携带率根据流式细胞仪检验要求,在完成一次样品检测后立即检测一支纯水空白管,记录30s内红细胞设定区域内检测到的颗粒数(N),重复200次,将检测到的颗粒数相加,用此数值除以红细胞设定区域内的细胞收集总数(A),并与重复次数作比,乘以100%得到污染携带率(CR)。公式为:CR=(N1+N2+…+N200)/(A×200)=108/(50000×200)=0.001%。计算所得结果符合仪器厂商推荐的污染携带率小于1%的要求,说明仪器连续进样检测不同样品不会因进样器污染而导致假阳性结果的出现。

2.3样品稳定性在8例97%/3%混合的血样和12例单一血样中分别任意挑选1例,分别分装在4个离心管中,冰箱4℃保存。在制备血样的第1、5、14、28天分别对这两例血样进行血型抗原检测,测定血液样品随时间变化的稳定性。结果显示,经过4周的冷藏存放,混合和单一血样图的锋形及相对位置无显著变化,检测结果稳定。

2.4操作稳定性在46例血样中选出6个样品,其中包含单一血样和各比例混合血样。将其分装成3份,分别由3位检测人员完成对血型抗原的检测,验证不同操作者对检测结果判定的一致性。结果显示,3位检测人员的检测及判断结果一致。

三、讨论

1方法验证本实验应用流式细胞术的血型血清学方法对46例血样进行红细胞血型抗原的检测,其中,12例单一血样的特异性验证结果全部为阴性,符合世界反兴奋剂机构关于兴奋剂检测方法的检测结果应满足100%阴性率和0%的假阳性率的特异性要求。对方法灵敏度的验证结果显示,3%及以上比例少量混合的红细胞被检出率达到100%。当少量混合的红细胞比例降低时,部分样品某些抗原表达与非表达的红细胞群分离效果不好,出现融合峰或拖尾峰影响判断,此时进行抗体优化程序可以解决或改善峰形问题。而当混合比例进一步降低至0.5%少量混合时,除了峰形问题外,由于定量结果低于抗体检测限而使混合血样检出率明显降低。造成这一结果的原因可能有:1)红细胞血型抗原密度和抗原性强弱不同,导致其与抗体结合能力存在差异;2)每种抗体效价不同,检测限也有高低,其检出能力由检测限值最高的抗体决定;3)这8种抗体分别为单克隆抗体IgM和IgG,由于抗体结构特点,结合了IgM抗体的红细胞更易聚集,造成单细胞悬液制备不完全,聚集的多细胞被检测为单细胞,导致定量结果低于检测限,因此,尽管有的检测人员能够从柱状图上观察到微弱的双峰,但由于测定到的混合比例低于检测限而不能将其判定为阳性。此外,流式细胞仪状态也会对检测结果造成影响,导致少量混合的红细胞信号无法被检测人员识别。噪音和污染携带率影响了流式细胞仪的检测能力,通过每次上机检测前对仪器的校正以及对噪音和污染携带率的计算,来评估仪器状态。仪器噪音过大,会掩盖微弱的双峰信号,导致假阴性结果的判定,而污染携带率过高则可能导致假阳性结果。因此,在检测过程中对仪器状态的确认是必要的。定期的维护和保养可以减少仪器本身对结果的影响。人体血量约为4~5L,其中,循环血量约占总血量的4/5。有研究显示,循环系统血红蛋白增加5%可以提高运动能力,输血量太少则达不到增加血红蛋白量进而提高有氧耐力的目的。由于异体输血伴随感染、溶血、血液粘稠、疾病传播等高风险因素,采用极少量输入多个供血者血液的可能性较小,因而,此方法的检测灵敏度能够满足兴奋剂检测的需要。通常红细胞在人体内的寿命约120天,这意味着,在异体输血后,理论上最多可以有长达3至4个月的检测窗口期能够检测到异体血液回输。相比传统兴奋剂只有几天的检测窗口期来说,该方法能够大大提高兴奋剂检查的效率。用细胞稳定液稀释的混合血样在冷藏条件下至少可存放4周,以此模拟运动员进行异体输血后一段时间体内不同红细胞群的比例关系。在4周内,不同操作人员对相同样品测得的混合红细胞群比例无明显变化,说明此方法稳定性好,可操作性高。

2阳性判定根据世界反兴奋剂机构(WADA)对于免疫抗原法检测兴奋剂的要求,异体血液回输阳性判定的标准为:在1份血样中,当有2个或2个以上特定红细胞抗原存在多于1种表型时,判定为异体血液回输阳性(AAF);当只有1个特定红细胞抗原存在多于1种表型时,判定为可疑(ATF)。正常情况下,每个人体内所有红细胞抗原的表达是唯一的,即要么表达,要么不表达,当体内某种红细胞抗原同时存在表达与不表达的情况时,即存在两种不同的红细胞群,提示有异体输血。当然上述判定还需要排除嵌合体血型情况。嵌合体血型多发生在异型输血、异卵双生、双精受精和异型骨髓移植后。异型输血、异型骨髓移植属于获得性嵌合(人工嵌合),异卵双生、双精受精是遗传嵌合,属于先天性嵌合。先天性嵌合,指在胚胎或妊娠时期形成的嵌合。先天性嵌合分两种情况,一种是由于妊娠早期异卵双生子之间存在血管交叉吻合,一方的造血干细胞经由吻合的血管通路进入到另一方体内,在获得性免疫耐受的基础上,不同来源的造血干细胞分别产生两群不同表型的红细胞。另一种是在受精过程中,由2个卵细胞和2个精子相互结合而产生四倍体,四倍体受精卵继续分裂就可能产生多种不同来源的细胞系。嵌合体现象会导致血型遗传不符合经典遗传规律。此外,某些疾病也会导致嵌合体现象。因此在采用本方法检测发现异体血液回输阳性时,运动员需进行嵌合体血型鉴定,以排除先天性嵌合情况。

3红细胞血型抗原血型是血液系统的一种遗传多态性。传统的血型概念指的就是红细胞血型,是指能以抗体来分类的红细胞抗原表型。红细胞血型抗原是红细胞表面的化学构型,其形成的物质基础是红细胞膜上的蛋白质及结合到脂质和蛋白质上的糖分子。根据生化特性不同,红细胞血型抗原可分为两类,一类是由糖分子结构决定的血型抗原,如ABO、Hh,Lewis,P,I等血型;另一类是由蛋白质结构决定的血型抗原,如Rh,MNS,Kell,Kidd,JK等血型。人类血型抗原由血型基因决定,同时受调控基因或修饰基因控制,具有个体差异性和种族差异性。WADA对于流式细胞术检测异体血液回输的方法中涉及到的红细胞血型抗原的选择未做明确规定,一般以红细胞血型抗原表型在人群中表达的比例作为选择依据,在人群中表达型和不表达型均占有一定比例的血型抗原可作为候选抗原。表3列出了不同研究、赛事及机构选择的血型抗原种类和数量。可以看出,尽管各研究根据人群表达情况不同,选择的血型抗原有所差异,但是都包括本文研究的这8种基本的血型抗原。本研究选择了8种公认的在人群中有适当比例分布的血型抗原进行中国人样本的检测分析的结果发现,受试的11名中国人中最多有3人存在ABO血型及其他8种血型抗原表型完全一致的情况。换句话说,假如这3个人相互之间进行异体输血,且排除了红细胞血型抗原密度的个体差异时,将不能被检测为阳性。理想状态下,能够检测的候选红细胞血型抗原种类越多,检测的假阴性率就越低,但对于大样本量的实际兴奋剂检测工作来说,可操作性较差。因此,科学地选择红细胞抗原种类进行检测,可以有效提高兴奋剂检测效率。李晟玮对Rh、Kell、Duffy、Kidd、Lewis、P、MNS和Luth等系统中的21个候选血型抗原进行了检测,发现其中Leb、E、Jka、Jkb、M、C、e、c等血型抗原更适合于检测中国人群异体血液回输,并发现增加检测血型抗原的数量,能够有效减少异体输血检测假阴性发生的概率。意大利的Donati等人也有类似报道,他们发现,在8种基本血型抗原的基础上增加另外5种(e,s,K,Lea,Leb)血型抗原后,能够提高混合血样的检出率。然而,在实际兴奋剂检测工作中,实验室检测人员无法得知所检测样品的运动员个人信息,这为根据不同种族运动员选择不同血型抗原的个性化的检测手段的实施带来一定难度。因此,在近两届奥运会异体血液回输的兴奋剂检测中,都只选择了这8种基本血型抗原进行检测。

四、小结

细胞技术范文第4篇

最近新发现的肌腱源性干细胞(TDSC)因在肌腱组织中的修复潜能而逐渐获得重视,但目前其对损伤肩袖腱-骨界面愈合作用机制研究鲜有报道。既往研究证实,TDSC具有向软骨、骨分化的潜能,因此其在损伤肩袖腱-骨界面愈合过程中可能扮演着中介作用。Shen等提取兔肩袖组织TDSC并进行培养,用于异体兔肩袖修复,结果显示12周后实验组腱-骨界面结构及生物力学指标均优于对照组,认为异体TDSC可增加肩袖胶原沉积,且可分泌抗炎因子以避免免疫排斥反应。Randelli等提取肩袖及肱二头肌腱组织TDSC并进行培养,比较TDSC与BMSC成骨细胞、脂肪细胞、肌骨骼细胞分化,结果显示TDSC具备很好的分化潜能,且优于BMSC。Tsai等的研究获得了与此相同的结果,还发现肩袖来源干细胞可表达种系特异性基因如成骨诱导的Runx2及骨钙蛋白、成脂分化的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ和脂蛋白脂肪酶(LPL),成软骨分化的聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原α1基因。Cheng等对肿瘤坏死因子-α刺激基因(TSG)-6在TDSC促进肩袖腱-骨愈合过程中的作用进行实验研究,结果显示TSG-6为保护性炎性反应性基因,在多种炎症性疾病或类似炎症过程中呈高表达,参与细胞外基质重塑,调节蛋白酶网络,在多种关节炎中有限制炎症、保护软骨的作用;认为TSG-6在TDSC促进损伤肩袖腱-骨界面愈合过程中具有良好的调控作用。然而,目前仍存在TDSC含量较少、难以完全分离和纯化、缺乏特异性表面标志物等问题,且TDSC体外诱导分化定向诱导机制尚不清楚,因此还需进一步研究。

2骨膜源性干细胞

骨膜可分为内、外两层,外层致密,有许多胶原纤维束穿入骨质,使之固定于骨面;内层疏松,可产生骨膜源性干细胞(PDSC)、成骨细胞及破骨细胞等。来自内层的PDSC具有一定的分化潜能,因此被认为可能在肩袖损伤愈合过程中具有一定的促进作用。Chen等从大鼠胫骨骨膜组织中提取PDSC并进行培养,将其与骨形态发生蛋白(BMP)-2制成凝胶混合物,采用该混合物对大鼠损伤肩袖进行修复,术后4、8周进行大鼠修复肩袖腱-骨界面组织学及生物力学分析,结果显示实验组最大腱-骨界面实效负荷明显高于对照组,且差异有统计学意义,免疫组化显示实验组修复界面存有聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白,认为PDSC与BMP-2的混合物可很好地促进腱-骨界面纤维软骨形成。目前大量实验将PDSC用于修复软骨缺损、骨缺损及骨不愈合,但其用于损伤肩袖腱-骨界面的修复鲜有报道,因此PDSC如何在重建腱-骨界面结构中发挥作用,仍需进一步研究。

3脂肪源性干细胞文献报道

脂肪源性干细胞(ADSC)与BMSC具有相似的分化潜能,其在合适的诱导剂作用下可分化为脂肪细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、成骨细胞和神经元样细胞。此外,ADSC具有数量巨大、获取方便、诱导安全、增殖迅速等特点,是一类有广阔应用前景的成体干细胞。Oh等采用ADSC修复兔慢性肩袖损伤模型,先切断兔肩胛下肌腱,6周后形成慢性损伤,此时进行肩袖修复,同时将ADSC注射入肩袖腱-骨区域及脂肪浸润的肩袖肌肉组织内以对肩袖进行加强修复,6周后从生物力学、肌电学、组织学方面对修复结果进行分析,认为ADSC可促进损伤肩袖腱-骨愈合,与对照组相比,实验组肌肉组织脂肪浸润区域明显较小。Kim等对兔亚急性肩袖损伤(切断冈上肌3周)修复的同时,将ADSC注射入邻近肌腹-肌腱移行部,术后3周观察类胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)及肌球蛋白重链(MyHC)在注射部位的表达,结果显示实验组IGF-ⅠR及MyHC表达明显高于对照组(注射生理盐水组),认为ADSC促进损伤肩袖修复有可能是通过IGF-Ⅰ信号转导通道完成的。虽然以上研究提示ADSC对退变性肩袖损伤具有促进愈合作用,但已往大部分研究均认为ADSC自我更新能力较差,不宜作为种子细胞。因•46•此,目前急需寻找更好的诱导剂,使其能更有效地分化成为目标组织,从而更好地促进损伤肩袖腱-骨界面愈合。

4肌源性干细胞体内研究显示

肌源性干细胞(MDSC)具有自我更新与多向分化潜能的特性,可再生为骨、软骨、肌肉、血液、神经及心脏组织。近期有研究报道MDSC同时具有肌腱组织的分化能力,但用于修复损伤肩袖研究鲜有报道。Pelinkovic等将MDSC用于修复裸鼠损伤冈上肌腱并进行观察,结果7d后细胞核呈纺锤形并集成肌腱胶原束,3周后检测到β-半乳糖苷酶基因表达,表明MDSC分化成表达波形蛋白的成纤维细胞,提示肩袖肌腱基质及原始细胞开始调控注射的MDSC向成纤维细胞分化;认为MDSC因具有分化为成纤维细胞的能力而可用于肌腱愈合组织工程及肩袖损伤治疗。

5滑囊源性干细胞滑囊源性

干细胞因肩峰下滑囊与肩袖紧邻而被认为有可能对肩袖修复产生一定的积极作用。Utsunomiya等将关节镜下提取的人肩峰下滑囊组织进行滑囊源性干细胞提取及培养,结果显示肩峰下滑囊组织可作为生物修复肩袖损伤良好的干细胞来源;将其与肩袖残端、滑膜组织中提取的干细胞进行成骨化及扩展性比较,结果显示滑囊源性干细胞具有最佳的扩展性及成骨性。Song等对在肩袖修补术中取出的部分肩峰下滑囊组织进行滑囊源性干细胞提取及培养,并用流式细胞仪对其进行分辨,排除造血干细胞及PDSC,再将此滑囊源性干细胞放于陶瓷支架中并将其植入裸鼠体内,其中部分用BMP-12予以刺激分化,最终支架区域出现包含胶原蛋白的腱样组织;因此认为,作为新型来源的干细胞,滑囊源性干细胞具有腱性组织分化潜能,而BMP-12对该过程具有一定的促进作用,滑囊源性干细胞有可能在肩袖损伤治疗中产生积极作用。肩峰下滑囊组织经肩关节镜手术取材方便,对肩袖修复无影响,但目前滑囊源性干细胞实验研究较少,仍处于起步阶段,其促进损伤肩袖愈合及进行定向诱导机制仍需进一步研究。

6结语

细胞技术范文第5篇

1.1一般资料

患者的入选是根据美国胸科协会制定的诊断指南,存在大于3周以上的咳嗽症状,有至少一条哮喘症状,并且体格检查出现相应体征的儿童患者随机纳入研究,研究时间从2012年1月~2014年6月。

1.2方法采用

流式细胞术。所收集样本冷冻保存,统一检测,末梢血样采集于肝素钠抗凝管中,取100μL血样加入中含有20μL白介素-3的缓冲液中,室温孵育10min,然后加入100μL儿童哮喘患者或健康对照组的血清,室温孵育20min,其中缓冲液包含0.12MNaCI,0.005MKCI,0.025MTris,pH7.6。N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP0.4mmol/L)(Sigma-Aldrich公司,圣路易,MO,USA),一种非特异性细胞活化剂,被用于阳性对照,洗涤缓冲液(0.01M磷酸缓冲盐水包括0.01M的磷酸二氢钠,0.01M磷酸氢二钠,pH为7.2~7.4)被用于阴性对照。孵育结束后将样品置于冷却的冰上防止嗜碱性粒细胞活化和降解,继而与荧光FITC结合的抗CD63抗体孵育BectonDickinson,FranklinLakes,NJ,USA),与荧光PE结合的抗IgE抗体(Pharmacia,Uppsala,Sweden),以及PerCP结合的抗CD45抗体(BectonDickinson)避光孵育20min,加入红细胞溶解液。2500rpm离心10min,将沉淀用缓冲液悬浮,BDFACSCantoⅡ流式细胞仪进行分析。在采集过程中,红色荧光(FL2)和前向散射(FSC)和侧向角散射(SSC)的特点是采用至少1000嗜碱性粒细胞的表达高IgE介导的面密度的选框进行分析,使用FSC/SSC特性淋巴细胞的定义。然后,从这些细胞,FL3/FL2图上嗜碱性粒细胞的认定为CD45低/IgE的高表达。

1.3统计学方法

使用SPSS®软件进行统计分析(SPSS公司,芝加哥,IL,美国)。x2检验用于比较患者组和对照组之间各个受体的表达情况。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

共纳入研究的哮喘儿童有72名,健康对照组32例。嗜碱性粒细胞的识别依赖表面受体的CD45的低表达和IgE的高表达,CD63的表达可用于识别嗜碱性粒细胞是否被患者或者健康对照组的血清激活。接受来自非过敏的健康志愿者的血清刺激后,抗FcεRI的自身抗体CD63的表达数目和比例如表1所示。29/78(37.2%)的哮喘患者血清表达CD63+的嗜碱性粒细胞,CD63+嗜碱性粒细胞的人数比例是为(36.9±8.3)%。与此相反,在健康组中的血清只有4/32(12.5%)对照表明CD63+嗜碱性粒细胞和嗜碱性粒细胞的“x±s”的比例人口,这是CD63+为(26.3±5.6)%。哮喘中的比重差患者与健康的比例。有CD63+嗜碱性粒细胞的对照组差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

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