本文作者：李明堂刘梦洋曹国军赵兰坡作者单位：吉林农业大学资源与环境学院

水土流失及溶质迁移是耕地，尤其是坡耕地土壤质量退化的主要原因之一，同时也是农业面源污染及其导致的自然水体质量恶化的重要因素。目前，国内外学者在这方面的研究主要集中在不同耕作和降雨条件下农田氮磷的流失机理、土壤－作物系统氮磷损失的定量评价和估算、氮磷流失对天然水体的影响等方面［1－4］。而关于受高氮磷含量农田径流污染水体的净化研究相对不足。黑土是松辽平原玉米带的主要土壤，由于长期连作和化肥投入量逐年增多，导致土壤水土流失严重，尤其是大量的氮磷进入封闭或半封闭水域后对水体富营养化的贡献日益突出，成为农业面源污染急需解决的问题之一［5］。我国东北的黑土区低温期长，且无植被时风蚀、雨水侵蚀和雪融水侵蚀导致大量的氮磷进入水体中。由于无水生植物的吸收净化作用，这些营养物质在水体中不断积累，成为水华爆发的内源污染负荷［6］。因此，减少非水华爆发期时水体中营养盐的内源负荷对降低水体富营养化水平将会产生积极意义。耐冷菌是指能在0～5℃生长繁殖，最高温度可达20℃以上的一类微生物，由于其具有抵抗环境变化的自我保护机制，所以在低温环境中占据独特的生态位并发挥重要作用［7］。研究表明，耐冷菌在低温环境中可保持较高的生长和代谢活性，能有效去除污水中的有机物和氮磷［8－9］。异养微生物在反硝化过程中不仅能从水体中脱除氮，而且会消耗大量的有机物，甚至会通过反硝化聚磷作用明显降低上覆水中磷酸盐的浓度，因此在治理受污染水体和净化水质方面正引起人们的重视［10－12］。本文模拟研究了1株从富营养化水体中分离得到的反硝化聚磷菌在不同条件下对农田径流污染水体中硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的去除特征，以期为受纳农田径流的富营养化水体的治理提供技术支持和理论依据。

1材料与方法

1．1实验用接种液

所用菌株为课题组从低温富营养化水体中分离出的1株耐冷反硝化菌，16SrRNA序列分析表明该菌株属不动杆菌属，与约氏不动杆菌的亲缘关系最近，将其命名为DBP－3，Genbank的登录号为JN314436，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（保藏号为CGMCC4753）。10℃时，在基础培养基中菌株能在好氧和缺氧条件下以硝酸根或亚硝酸根为电子受体进行反硝化作用，好氧时可过量吸收磷酸盐聚集于细胞内，厌氧时有明显的释放磷现象。实验前将保存于斜面的菌株挑取1环，接种于反硝化液体培养基中，在10℃和低溶解氧下静置培养至对数生长期时于8000rpm下离心5min收集菌体，用无菌水洗涤菌体后，再悬浮于无菌水中，制成接种液（600nm处吸光度约为0．3），使用时接种量为1％（V／V）。液体培养基：NaAc1．0g，KH2PO40．1g，MgSO4•7H2O0．2g，NaCl0．2g，（NH4）2SO42．0g，CaCl2•2H2O0．025g，微量元素溶液1．0ml，蒸馏水1000ml，pH＝7．2。微量元素溶液：EDTA10．0g，ZnSO42．2g，CaCl25．5g，MnCl2•4H2O5．06g，FeSO4•7H2O5．0g，（NH4）6Mo7O2•4H2O1．1g，CuSO4•5H2O1．57g，CoCl2•6H2O1．61g，蒸馏水1000ml，pH＝7．2。

1．2农田地表径流的收集

选择吉林农业大学玉米试验田作为农田地表径流的收集场所。2010年5月于大雨的前1d布下农田径流收集装置。在田间的低洼处挖1坑（60cm×60cm×60cm），放入5L的雨水收集器。在收集器顶部遮盖以收集器为圆心，半径为1m的圆形遮雨布，使得下雨期间，收集器周围1m内无降雨，以便流入收集器的地表径流中能更多地溶解氮磷等营养物质。收集器盛满地表径流后，将其取出拿回实验室，静置10min，再用中速滤纸过滤，收集滤液与富营养化水以1∶1的比例混合，作为实验用水，其中硝酸盐氮浓度为5．78mg／L，溶解性正磷浓度为0．56mg／L。将水样保存于－20℃冰箱中，所有实验在2个月内完成。

1．3菌株好氧脱氮除磷实验

1．3．1培养条件和水样预处理

向水样中接种后，在10℃下振荡培养（150rpm），同时设不接种的对照处理。定期采集水样，过0．45μm滤膜抽滤后测定硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的浓度。

1．3．2菌株对水样中氮磷的去除及其定殖能力

分别向原水样和灭菌水样（121℃高压蒸汽灭菌）中接种并培养，在培养的第2，4，6，8天采集水样，进行硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的测定。每天采集水样并测定投加菌株的菌体细胞数量和细菌总数。

1．3．3其他条件对菌株脱氮除磷能力的影响

温度：原水样接种后分别在5，10，25℃下培养，5d后采样测定氮磷浓度。盐度：按照0％，1％，5％和10％的比例（m／V）向原水样中分别添加氯化钠，然后再加入接种液，10℃培养5d，采样测定氮磷浓度。农药：分别将多菌灵和毒死蜱制成浓度为1000mg／L的储备液，梯度稀释后添加于原水样中，2种农药的最终浓度都为0，20．0，40．0，60．0，80．0，100．0mg／L，接种后培养5d，测定氮磷的浓度。多菌灵的储备液用稀盐酸溶液和甲醇配制，毒死蜱的储备液用氯仿配制。1．4分析测定方法硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐分别采用酚二磺酸分光光度法和钼锑抗分光光度法［13］测定。菌体细胞数量测定采用梯度稀释平板计数法，培养基为加入1．8％琼脂的反硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨固体培养基。每种处理3次重复，结果为各项指标的平均值。

2结果与分析

2．1菌株对水样中氮和磷去除的作用

将灭菌水样＋菌和原水样＋菌2种处理及只有灭菌水样或原水样的2种对照处理在10℃下避光培养，定期采集水样并测定硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的浓度，以研究菌株的脱氮除磷能力，结果如图1所示。从图中可看出，整个实验周期内，与未投加菌株的对照处理相比，投加菌株后培养体系中硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的去除率和去除速度明显增加。菌株对灭菌水样和原水样中硝酸盐氮的最终去除率分别为78．5％和70．2％，对溶解性正磷酸盐的去除率分别为82．4％和74．6％，菌株对水样中磷的去除能力稍大于对氮的去除能力。在未投加菌株情况下，原水样培养一段时间后，硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的浓度仍有一定程度降低，而灭菌水样中硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐浓度变化不明显。可以推断，低温条件下投加的菌株对水样中硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的去除起主要作用，菌株可通过反硝化作用和聚磷作用快速降低水中的氮和磷；同时原水样中存在一些其他生物，随着培养时间延长，这些生物不断吸收或转化水体中的硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐，对水样中氮和磷的去除也起到一定的作用。但由于低温条件下，其他生物的代谢活动缓慢，因此实验周期内对照处理中营养盐的去除效果不明显。以上结果说明，菌株在强化修复低温富氮磷水体方面具有一定的应用潜力，但须采取一些其他措施进一步提高菌株的脱氮处理能力，如菌株的固定化等。

2．2菌株在原水样中的定殖

向原水样中接入菌种，在10℃下培养，定期采集水样，通过平板计数法分析水样中投加菌株的数量动态变化及占水样中细菌总数的百分比，结果如图2所示。表明，菌株加入到水样中后，在整个培养期间内数量上呈现缓慢上升和快速下降的过程，但在培养末期数量仍然可达4×105CFU／ml。实验初期菌体细胞数量增加不明显，但从第2天到第4天数量增加相对较快，说明菌株加入到水样中后具有一定的生存优势。随着营养物质的逐渐消耗和其他低温生物的竞争导致在培养后期菌株出现数量快速下降现象。整个培养过程中菌株占水样中细菌总数的比例范围为68．3％～89．1％，说明菌株在低温微生物生态系统中可占据数量上的优势，在实际生物修复中可对自然环境产生较强的适应能力，具有明显的应用优势。测定采用梯度稀释平板计数法，培养基为加入1．8％琼脂的反硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨固体培养基。每种处理3次重复，结果为各项指标的平均值。

2结果与分析

2．1菌株对水样中氮和磷去除的作用

将灭菌水样＋菌和原水样＋菌2种处理及只有灭菌水样或原水样的2种对照处理在10℃下避光培养，定期采集水样并测定硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的浓度，以研究菌株的脱氮除磷能力，结果如图1所示。从图中可看出，整个实验周期内，与未投加菌株的对照处理相比，投加菌株后培养体系中硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的去除率和去除速度明显增加。菌株对灭菌水样和原水样中硝酸盐氮的最终去除率分别为78．5％和70．2％，对溶解性正磷酸盐的去除率分别为82．4％和74．6％，菌株对水样中磷的去除能力稍大于对氮的去除能力。在未投加菌株情况下，原水样培养一段时间后，硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的浓度仍有一定程度降低，而灭菌水样中硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐浓度变化不明显。可以推断，低温条件下投加的菌株对水样中硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的去除起主要作用，菌株可通过反硝化作用和聚磷作用快速降低水中的氮和磷；同时原水样中存在一些其他生物，随着培养时间延长，这些生物不断吸收或转化水体中的硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐，对水样中氮和磷的去除也起到一定的作用。但由于低温条件下，其他生物的代谢活动缓慢，因此实验周期内对照处理中营养盐的去除效果不明显。以上结果说明，菌株在强化修复低温富氮磷水体方面具有一定的应用潜力，但须采取一些其他措施进一步提高菌株的脱氮处理能力，如菌株的固定化等。

2．2菌株在原水样中的定殖

向原水样中接入菌种，在10℃下培养，定期采集水样，通过平板计数法分析水样中投加菌株的数量动态变化及占水样中细菌总数的百分比，结果如图2所示。表明，菌株加入到水样中后，在整个培养期间内数量上呈现缓慢上升和快速下降的过程，但在培养末期数量仍然可达4×105CFU／ml。实验初期菌体细胞数量增加不明显，但从第2天到第4天数量增加相对较快，说明菌株加入到水样中后具有一定的生存优势。随着营养物质的逐渐消耗和其他低温生物的竞争导致在培养后期菌株出现数量快速下降现象。整个培养过程中菌株占水样中细菌总数的比例范围为68．3％～89．1％，说明菌株在低温微生物生态系统中可占据数量上的优势，在实际生物修复中可对自然环境产生较强的适应能力，具有明显的应用优势。

2．3温度对菌株脱氮除磷作用的影响

向原水样和灭菌水样中加入菌悬液，分别在5，10，25℃下培养5d后采集水样，测定硝酸盐氮和溶解性正磷酸盐的浓度，分析不同培养温度下菌株对水样中氮磷的去除，同时设不加菌的对照处理（图3）。结果表明，随着温度升高，模拟系统中氮磷的去除率逐渐增加。但5℃时菌株仍保持活力，原水样和灭菌水样中硝酸盐氮的去除率分别为26．7％和29．4％，溶解性正磷酸盐的去除率分别为37．4％和23．5％，与未投菌的对照处理相比差异显著；25℃时，投菌的原水样和灭菌水样中硝酸盐氮的去除率分别为76．3％和69．2％，溶解性正磷酸盐的去除率分别为83．6％和72．5％。可以推断低温条件下（5℃和10℃）水样中去除的氮磷主要是投加菌株的作用，水中的其他生物活性很低，对氮磷去除的贡献及其与投加菌株的竞争能力可忽略。随着温度升高，其他生物的活性开始恢复，对水样中氮磷的去除有一定的贡献，而投加菌株的生态优势逐渐失去。

2．4盐度对菌株脱氮除磷作用的影响

分别按照质量体积比为0％，1％，5％和10％的比例向水样中加入氯化钠，研究盐度对水样中菌株脱氮除磷能力的影响，结果如图4所示。从图中可看出，氯化钠浓度为1％时，菌株对培养体系中氮磷的去除能力未受到任何影响，当盐浓度达5％时，培养体系中氮磷的去除率开始有所下降。当盐度达10％时，菌株的脱氮除磷能力受到明显抑制。天然水体的盐度会因融雪剂的使用、河流径污比的降低和污水处理厂出水的排放等原因而增加，从而对微生物的生长代谢活动产生影响［14］。研究表明，菌株DBP－3对盐度具有一定的耐受性，当氯化钠浓度达10％时菌株的除磷能力才受到显著影响，因此该菌株对水体中盐浓度冲击的忍受能力可能较强，应用价值高。

2．5农药对菌株脱氮除磷作用的影响

多菌灵和毒死蜱2种农药对菌株脱氮除磷能力的影响特征如图5所示。从图中可看出，低浓度的多菌灵对菌株的脱氮除磷能力无明显不利影响，甚至具有一定的促进作用，但随浓度增加，对菌株生长代谢作用的影响越来越明显，当浓度达到60．0mg／L时，菌株的脱氮除磷能力开始受到不利影响，达到100．0mg／L时，菌株基本失去对氮磷的去除能力，从培养体系的浊度变化可看出，菌株的生长被完全抑制。与多菌灵相比，当毒死蜱浓度为40．0mg／L时，菌株的脱氮除磷能力就开始受到影响，随着毒死蜱浓度增大，菌株的脱氮除磷能力逐渐减低；当毒死蜱浓度增大到80．0mg／L时，菌株的脱氮除磷能力受到极强的抑制。通过以上分析可看出，菌株对多菌灵和毒死蜱具有一定的抗性，只有在较高浓度时多菌灵和毒死蜱才对对菌株的氮磷去除能力产生明显的抑制，因此在实际应用中基本不会产生影响，但值得注意的是，毒死蜱对菌株的毒性作用大于多菌灵。

3结论与讨论

（1）农业面源污染不仅使得土壤质量因大量氮和磷的流失而日益下降，而且这些营养盐会通过各种途径进入天然水体中，加速了水体的富营养化进程，对饮用水安全和生态系统健康构成了严重威胁，成为急需解决的问题之一。我国北方，尤其是东北地区低温期时，地表无植被覆盖，风、雨水和雪水冲刷极易导致土壤中营养物质流失，但由于水体中无水华现象，因此水体中营养盐的积累问题往往容易被人们忽视。低温菌和耐冷菌由于具有较强的低温适应能力，在水环境中营养盐的去除方面正引起人们的重视。本文研究了通过低温定向驯化技术从富营养化水体中分离出的1株土著耐冷菌对农田径流污染水体中硝酸盐和溶解性正磷酸盐的去除特性。结果表明，该菌株在模拟系统中具有较强的适应能力，能够明显去除导致水体富营养化的关键营养因子，对常见的水体环境因子盐度和农药具有一定的抗性，具有广阔的应用前景。（2）实际应用过程中由于多种环境因子同时起作用，以及其他生物对营养物质的竞争，单一菌株的生态优势往往容易发生变化。因此，下一步应从菌群的角度进行研究，发现不同微生物间的功能关系，从而在实际应用过程中让优势菌处于适宜的生态幅内，使其发挥最大的脱氮除磷能力。同时，由于聚磷作用主要发生在氧气相对充足的情况下，因此可通过微生物固定化作用，让其处于高溶解氧环境，以便保持高效的氮磷代谢能力。