本文作者：王建国1,2许琴瑟1王权1熊良伟1陆宏达1封琦1朱云干1作者单位：1江苏畜牧兽医职业技术学院2上海海洋大学水产与生命学院

试验结果

1温度对酚氧化酶活力的影响

不同温度下克氏原螯虾鳃组织PO活力变化如图1，血清PO活力变化如图2。鳃组织PO活力大于血清PO，不同温度下鳃组织和血清PO活力变化规律很相似。0～35℃内PO活力均随温度上升逐渐增大，各温度组鳃组织PO活力均存在显著差异(P＜0.05)，其中血清PO活力除20℃与25℃和25℃与30℃无显著差异外，其余各组间均有显著性差异(P＜0.05)。35～45℃之间PO活力逐渐下降，但尚未达到显著差异水平(P＞0.05)。当温度高于45℃时PO活力急剧下降，各组间存在显著差异(P＜0.05)。温度低于35℃时样品对照组引起的吸光度值较小，高于40℃时吸光度迅速增大，影响测定结果。0℃冰水浴中PO仍具有一定活力，约为25℃时的31%，35℃时的24%。温度低于35℃时底物对照组引起吸光度变化较小，35℃以上随温度升高吸光度逐渐升高，40℃开始吸光度显著高于35℃以下温度组(P＜0.05)，65℃时吸光度最高，为35℃时的16倍。说明温度过高时底物引起的吸光度变化会干扰PO测定。

2缓冲液pH对酚氧化酶活力的影响

在不同pH环境中鳃组织中PO活力变化如图3。鳃组织中PO在pH5.5时活力最高，除与pH6无显著差异外(P＞0.05)，均显著高于其它组(P＜0.05);pH6时与pH7～10各组间均存在显著性差异(P＜0.05)。PO具活力的pH范围为4～9.5，最适pH为5.5～6。结果显示偏酸性缓冲液中PO活力较高。不同pH环境中血清中PO活力变化如图4。血清中PO活力在pH6.5时最高，显著高于其它组(P＜0.05)。具活力的pH范围为5.5～8.5，pH为5.5～6和7～8各组间无显著性差异(P＞0.05)，pH低于5和高于9时活力迅速下降。pH5以下时样品引起吸光度变化较大，pH越低吸光度变化越明显;pH8.5以上时底物L-DOPA会生成红棕色物质，pH越大越明显，对测定干扰较大。以上结果说明pH对血清PO和鳃组织PO的影响存在一定差异。

讨论

1温度对酚氧化酶活力的影响

日本对虾［10］、日本［11］等酚氧化酶与L-DOPA反应的最适温度为40℃，白对虾和斑节对虾［12］最适温度为45℃，南美白对虾［13］最适温度为50℃，中国对虾［5］最适温度为55℃，龙虾［14］的最适温度为30℃，锯缘青蟹［15］最适温度为25℃，朱毅菲等［7］报道克氏原螯虾最适温度为20℃。从以上数据可以看出甲壳动物种类不同其PO最适温度具有较大差异，在20～55℃之间不等，因此在进行PO活力测定中根据品种选用合适的温度条件是非常必要的。在本实验设计的温度范围(0～75℃)内，克氏原螯虾血清和鳃组织中PO的最适温度均为35℃，朱毅菲等［7］的实验结果中温度从20～50℃PO活力是呈下降趋势，最适温度为20℃，这两个结果差异很大。但其未设置温度低于20℃的情况，70淡水渔业2012年在20℃以下PO活力不清楚的情况下判断最适温度为20℃是不严密的。本实验所采用的克氏原螯虾也是暂养在20℃左右，与朱毅菲等的实验结果差异较大。朱毅菲等［7］认为克氏原螯虾血清PO活力在20℃最高的原因是实验用虾处于22℃的水中已适应了此温度环境，在越接近其生活环境的温度下酶活力越高，反应越彻底;而反应温度与螯虾环境温度差异越大，对酚氧化酶造成的破坏越大。日本沼虾［4］、日本对虾［10］、南美白对虾［13］、中国对虾［5］等多种甲壳动物PO最适温度都高于其生活温度，克氏原螯虾适应能力极强，在10～30℃能正常生长发育，因而仅以适应了实验温度解释其最适温度是不可取的。另外朱毅菲等［7］的结果显示当温度达到50℃以上时PO活力会出现升高的现象，其实不是活力真正升高，而是因为当温度升高时样品和底物均会产生较大吸光度所致(如图1，2)，所以如果没有设置空白对照扣除这部分差值就会得出50℃以上活力反而升高的结果，因此朱毅菲等［7］计算PO活力的方法也存在不妥之处。笔者认为本实验所得出的克氏原螯虾酚氧化酶最适温度为35℃可靠性更高，而朱毅菲等通过试验得出最适温度为20℃的结果是不够准确的，一方面可能是由于试验本身造成，另一方面可能和所选实验对象的生活环境及地区差异等有关造成。本实验还测定了冰水混合物(0℃)时鳃组织和血清中PO的活力均为最高值的24%左右。许多学者在测定PO活力时均借鉴其他酶活力的测定工艺，使底物与样品反应一段时间后采用冰浴法来终止反应［5-6］，这在克氏原螯虾PO活力的测定中是有不妥之处的。冰浴只能在一定程度上减缓反应速度，无法达到和其他酶同等的效果，因此该方法的使用有待学者斟酌。

2缓冲液pH值对酚氧化酶活力的影响

动物体液的pH因种类不同而有一定差异，不同甲壳动物PO最适pH也不完全相同。汪小锋等［16］报道中国对虾最适pH为6.0，杨玲玲等［11］报道日本最适pH为6.0，夏栋等［14］报道龙虾最适pH为6.3，赵丙辰等［13］报道南美白对虾最适pH为6.0，而陈丽娇等［17］报道南美白对虾最适pH为7.0，赵娇等［10］报道日本对虾最适pH为6.5，陆宏达等［8］报道中华绒螯蟹最适pH为6.5，潘清清等［15］报道锯缘青蟹最适pH为7.8，以上报道的经济甲壳类PO最适pH大多在6～8之间，一些昆虫PO最适pH在5.0～9.5。本试验结果显示克氏原螯虾鳃组织PO最适pH为5.5，血清PO最适pH为6.5，与朱毅菲等［7］报道的血清酚氧化酶最适pH为7.0的结果基本相似。克氏原螯虾和大部分甲壳动物相似，在偏酸性的环境中PO活力相对较高。有学者认为偏酸性的环境会影响一些生物的PO活力［18］，和许多甲壳动物的研究结果不同，所以不同物种的PO特性具有较大差异。本实验得出的最适pH和朱毅菲等［7］的结果略有差异，赵丙辰和陈丽娇报道的南美白对虾最适pH也存在一定差异，说明不同的生活环境及物种地区差异对PO特性也可能有影响。本实验得出鳃组织PO活力的最佳pH为5.5，血清为6.5，具有一定差异;鳃组织PO活力大于血清PO与其他实验中呈现的结果相似［8］，这说明同一物种体内不同部位的酚氧化酶不完全相同。甲壳动物PO的最适温度、pH及激活剂、抑制剂等生化性质存在差异，其酚氧化酶基因也有一定差异，但都具有将酚氧化成醌的共同性质［19］，所以PO生化特性受物种差异影响较大，不同物种和不同组织都不能一概而论，具体差异还有待更多学者深入探讨。Pind等［20］报道在测定PO时要尽量中和环境中多余的OH－以减少其和底物L-DOPA发生反应引起吸光度造成测量误差。本实验显示样品在pH值5～8.5的缓冲液中吸光度变化不大，L-DOPA在酸性和中性缓冲液中较稳定，当pH超过8.5时溶液会生成黄棕色物质，出现较大吸光值，pH值越大引起吸光度变化也越大，会干扰测定。因此在PO活性测定中需要设置底物和样品对照，才能使结果更加准确。