本文作者：宋霖蔡春芳叶元土王永玲刘猛孔丽作者单位：苏州大学

材料与方法

1试验饲料

试验所用鱼粉(FM)购自通威股份有限公司，为俄罗斯进口鱼粉(粗蛋白64.5%、粗灰分14%、粗脂肪5.6%、组胺334mg/kg);鱼油购自浙江金大地饲料有限公司，豆粕(粗蛋白43.5%、粗纤维5.1%)、花生粕(粗蛋白44.7%、粗纤维5.9%)、菜籽粕(粗蛋白38.6%、粗纤维18%)和棉籽粕(粗蛋白47%、粗纤维10.2%)购自东海粮油工业张家港有限公司。对照组鱼粉含量为60%。试验饲料中豆粕、花生粕、棉粕和菜粕的添加水平分别为25%和50%(表1)。本试验未采用传统营养学研究使用的等氮等能配方，一是因为饲料原料中的抗营养因子［9-11］会影响到肠道形态，设计等氮等能饲料必然要加入其它原料，可能会干扰结果的可靠性。二是因为实验目的是评价原料安全性，不需要饲料等氮等能。三是大量关于肠道健康研究的文献也都采用了非等氮等能的饲料［12-14］。各饲料原料粉碎至全部通过60目筛，按配方比例混合均匀后制成直径2mm的硬颗粒饲料，通风场所内自然风干，于－20℃冰箱中储存备用。饲料配方组成及营养水平见表1。

2试验鱼及分组

试验用黄颡鱼购于苏州市水产养殖总场澄湖场，为当年池塘养殖鱼种。运回实验室后用对照组饲料驯养，适应实验室环境后(1周)，选取大小均匀、体格健壮，体质量为(295±0.35)g的鱼种，称重后随机分配到45个玻璃钢水族箱中(110cm×70cm×65cm)，每缸15尾。各试验组按完全随机化配置法分布以避免位置的差异造成的试验误差。

3饲养管理

所有水族箱在同一半开放式可控温循环养殖系统中，以充分曝气的自来水为水源，每天换水为总水量的1/3。养殖水经过滤、沉淀后流回蓄水池，经过增氧、控温后由水泵抽回各水族箱。饲养期从2010年4月7日至2010年6月2日，为期8周。养殖期间光周期12h∶12h，水面照度(2500±300)Lx，水温(25±2)℃，DO＞5.0mg/L，pH7.5±0.2，NH4+-N(0.25±0.05)mg/L，NO2－N(0.04±0.01)mg/L，硫化物＜0.05mg/L。每种饲料投喂5缸黄颡鱼，每日投饲3次(8∶00，13∶00，18∶00)，饱食投喂。

4采样与分析方法

采样均在摄食后半小时进行，迅速将鱼捞起，使用MS-222麻醉，统计各组试验鱼的尾数，计算成活率;称量每缸鱼的总体质量，计算蛋白质效率。测定体长，解剖取肠道并测定肠长，计算肠长指数。成活率(SR)=(Nt/N0)×100%蛋白质效率(PER)=(Wt－W0)/CP×100%肠长指数=GL/BL上式中，Nt表示试验末鱼尾数，N0表示试验初鱼尾数，Wt表示试验末每缸鱼体总重，W0表示试验初每缸鱼体总重，CP表示每缸饲料蛋白摄入量，GL表示肠长，BL表示体长。每个处理随机取10尾鱼，分离出肠道，剔除表面脂肪组织，在肠道第一个回折后1cm处剪取中肠1cm左右大小的组织块(图1)，迅速固定于Bouin’s液中。试验取中肠是因为对黄颡鱼的前期研究发现，黄颡鱼中肠对于饲料组分比较敏感。按常规组织切片制备程序，进行水流冲洗、梯度乙醇脱水，二甲苯中透明以及石蜡包埋。然后使用YD-202型切片机横向切片，厚度为5μm，展片后采用H-E染色，中性树胶封片。使用OLYMPUSDP72光学显微镜观察并拍片，肠道形态的评价参ST:胃;FG:前肠;MG:中肠;HG:后肠;SL:取样部位数包括:消化管横切面上的黏膜皱褶个数;肠道黏膜褶皱的高度与宽度;褶皱中固有层的宽度;黏膜下层厚度;嗜碱粒细胞向固有层和黏膜下层的渗透程度;核上空泡的存在与多少;肌层厚度。

5数据统计

试验结果采用“平均值±标准差”表示，所有统计分析采用SPSS17.0软件，数据经方差分析后用Turkey’s多重比较，以分析组间的差异显著性程度，显著水平为0.05。

结果与分析

1黄颡鱼生长及四种植物蛋白对其影响

整个试验过程中无异常情况发生，黄颡鱼增重一倍左右，各组成活率均为100%。对照组的蛋白质效率高于所有实验组，除豆粕组外其余试验组蛋白质效率随着饲料中植物蛋白水平提高而下降。豆粕组和棉粕组与对照组无显著差异(P＞0.05)，50%花生粕组和50%菜籽粕组的蛋白质效率均显著小于对照组(P＜0.05)。

2黄颡鱼肠道形态及四种植物蛋白对其影响

饲喂不同含量的四种植物蛋白8周黄颡鱼中肠组织形态发生了一定程度的改变(表3)。各试验组肠长指数相较对照组均有所增大，但无显著性差异(P＞0.05)。观察黄颡鱼中肠的组织切片发现:肠道组织结构可分为黏膜层(mucosa)、黏膜下层(submucosa)、肌层(muscularis)和浆膜层(serosa)，摄食鱼粉饲料的对照组黄颡鱼中肠黏膜层向肠腔内折叠形成丰富的黏膜褶，黏膜褶形状完整，有的笔直伸入肠腔内，有的弯曲伸展，有分支，排列密集。肠黏膜由单层柱状上皮细胞组成，上皮细胞排列紧密而整齐，核圆形位于细胞中部。黏膜褶高度及宽度均大于各植物蛋白组，肌层厚而致密(图版Ⅰ－1，2)。25%豆粕组黏膜褶数目较对照组有所减小，是试验组中密度最大的(表3)。黏膜褶略有缺刻，顶端与食糜接触的部分有损伤，黏膜褶中单层柱状细胞破损，细胞核挤在一起。固有层中略有淋巴细胞浸润，空泡数目略有增多(图版Ⅰ－3)。50%豆粕组黄颡鱼黏膜褶之间排列变稀疏，根部的黏膜上皮细胞即被破坏，有的黏膜褶整个受损，上皮细胞核上移且排列紊乱，边缘缺刻较多(图版Ⅰ－4)。黏膜褶高度显著小于对照组，肠壁厚度亦显著变薄且肌层稀疏(P＜0.05;表3)。25%花生粕组黏膜褶较密集，黏膜褶高度较对照组降低了24.4%(表3)。黏膜褶顶部有破损且明显变细，肠黏膜上皮细胞之间界限不清晰，空泡较多，且大小不一。黏膜下层有所增厚，但未见淋巴细胞侵入(图版Ⅰ－5，6)。添加水平为50%的花生粕组黏膜褶数目及宽度进一步减少。黏膜高度显著低于对照组(P＜0.05;表3)。黏膜褶呈倒伏状，边缘缺刻严重，空泡变大，有的黏膜褶的上皮细胞均被破坏，核排列紊乱。固有层仍较宽(图版Ⅰ－7)。25%菜粕组黏膜褶外侧遍布空泡，有的黏膜褶中上皮细胞核明显上移，淋巴细胞侵入黏膜褶中，大片上皮细胞破损(图版Ⅰ－8，9)。上述结构在50%菜粕组中同样出现(图版Ⅰ－10)，且各项肠道生长指标较25%水平进一步减小。棉粕组黄颡鱼的黏膜高度与肌层厚度均与对照组有显著性差异(P＜0.05;表3)。25%水平时，淋巴细胞侵入固有层和黏膜下层中，数量上较其余试验组显著增多，空泡密集且大小不一(图版Ⅰ－11)。50%水平时，黏膜褶最少，但没有大量淋巴细胞浸润情况，空泡较大，上皮细胞边界不清(图版Ⅰ－12)。

讨论

本试验日粮中分别添加了豆粕、菜粕、花生粕和棉粕，由于与鱼粉相比在蛋白质含量、能量含量、氨基酸组成、消化吸收率、抗营养因子等方面均处于劣势［15］，引起生长不良是在预期之内的。豆粕是优质的植物蛋白源，然而其中含有植酸、皂苷和血细胞凝集素等抗营养因子［11，16］。Krogdahl等［17］指出多数植物凝集素可以和小肠壁上皮细胞表面特异受体(多糖)结合，使绒毛产生病变和异常，干扰消化吸收过程。Iwashita等［18］报道大豆皂苷能与植物凝集素结合而引起虹鳟后肠非正常的组织学反应。大西洋鲑鱼在豆粕添加量10%以上就产生严重的肠炎反应［19］，但另一方面Ostaszewska等［20］发现在细鳞鲳日粮中添加44%的豆粕，其前肠组织形态与对照组相似，Catacutan等［21］也报道银纹笛鲷在豆粕添加量达到48%时肠道结构没有表现任何不正常。从本试验结果看，黄颡鱼对豆粕的耐受性比大西洋鲑鱼高。Uran等［22］观察到豆粕诱导的肠炎在鲤鱼饲养4～5周时开始修复，本试验中肠道样品采集于饲养8周，结果仍观察到病变症状，提示黄颡鱼肠道对豆粕的适应能力低于鲤鱼。目前对于日粮中添加花生粕而影响动物健康的原因一般认为是花生粕容易感染黄曲霉，黄曲霉产生的黄曲霉毒素(Aflatoxin)会抑制水产动物生长并对其生理机能造成一定的影响［23］。鱼类中毒症状表现为生长缓慢、肝脏和其它器官受损、死亡率增加［24］。从本试验结果看，黄颡鱼花生粕适宜添加量在25%以下。本试验中菜粕添加量为25%时即引起中肠严重的病理反应，添加量达到50%时对于肠道生长更加不利。菜籽中含有硫葡萄糖苷，其水解产物有异硫氰酸酯、硫氰酸酯等。异硫氰酸酯有辛辣味，长期或大量饲喂会引起肠炎［25-26］。因此菜粕的添加量不宜超过25%。棉粕中游离棉酚的毒性限制了其在水产饲料中的应用，游离棉酚的活性醛基和羟基与蛋白质结合，会抑制鱼的生长［27-28］、降低血红蛋白数［29］。而异育银鲫中棉粕的添加量在20%，40%，56%时对生理和肠道健康均未造成显著性影响［30］。对虹鳟三年的养殖试验也发现日粮可以完全以棉粕替代而对其生长不会造成损害［31］。本试验发现25%棉粕组肠道黏膜下层有淋巴细胞浸润，50%棉粕组淋巴细胞浸润没有增强，且棉粕组蛋白质效率与对照组没有显著差异，说明黄颡鱼对棉粕有一定的适应性及耐受力。总体来看，饲料中添加高剂量的植物蛋白黄颡鱼肠道形态都表现出了一定的变化。鱼类肠道形态因饲料组分不同而改变这种现象在大西洋鲑［19］、鲤鱼［22］、欧洲真鲈［32］都有报道，本实验中黄颡鱼肠道形态的变化特征与上述报道基本一致。但鱼类对植物蛋白中致敏因子的炎症反应因鱼而异。Refstie等［33］研究大西洋鳕鱼时，不添加豆粕和添加25%的试验组在肠道区域形态学上没有发现明显不同。斑点叉尾鮰［34］和埃及鳎［35］也没有因为摄食含豆粕的饲料而出现肠道形态学变化。显然，黄颡鱼属于对这些植物蛋白中的致敏因子比较敏感的种类。因此，在饲料原料选用时应谨慎。本试验观察到肠道肌层厚度组间差异显著。这在文献资料中很少报道。我们推测，植物蛋白中所含的大量不消化成分，例如非淀粉多糖等，导致肠道充盈度提高，肠腔扩张，从而可见肌层变薄。由此我们认为今后进行相关研究时不仅应在摄食后相同时刻采样，且不需将肠道剖开，这样就能判断肌层厚度和绒毛高度与肠道充盈度是否相关。根据本试验研究，在黄颡鱼饲料植物蛋白选用时，豆粕和棉粕要优于花生粕和菜粕，花生粕、棉粕、菜粕适宜添加量在25%以下，豆粕在50%以下，但具体安全添加水平还有待研究。