本文作者：孟庆国1陈静1黄艳青2靳明建3顾伟1王文1作者单位：1南京师范大学生命科学学院2中国水产科学研究院东海水产研究所

材料与方法

1实验材料

实验动物:健康红螯螯虾购自南京某养殖场，体重10～20g，于室内水循环系统中暂养(通气、换水)，水温24～26℃，每天投喂饲料。实验试剂:Trizol试剂为Invitrogen公司产品;普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和pMD－18T载体等均为TaKaRa公司产品;SMARTTMcDNAlibraryconstructionkit和SMARTTMRACEcDNAAm-plificationKit购自Clontech公司，其它试剂为国产分析纯。大肠杆菌DH5由本实验室保存。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2总RNA提取和cDNA文库构建

2mL一次性注射器抽取红螯螯虾血淋巴，迅速与等量的抗凝剂混合(葡萄糖05g;柠檬酸0.8g;氯化钠0.42g;双蒸水定容至100mL)，2000g、4℃离心样品10min以收集血淋巴细胞。参照Trizol试剂操作提取总RNA，测定RNA的浓度和纯度，2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。按照SMARTTMcDNAlibraryconstructionkit说明书构建红螯螯虾血淋巴细胞cDNA文库。合成双链的cDNA连接到pMD－18T载体中，转化到E.coliDH5感受态细胞中，经PCR鉴定为阳性克隆后送华大公司测序。测序得到序列经BLAST比对后得到红螯螯虾的冷休克YB基因的部分序列。

3RACE及全长序列的获得

根据已经得到的冷休克YB基因的部分序列设计5''''和3''''RACE引物(表1)。在进行5''''和3''''RACE反转录时，YB5R和NUP引物用于扩增5''''端，YB3F和NUP引物用于扩增3''''端。RACE步骤按照SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit说明书进行。扩增得到的片段纯化并连接入载体后送华大公司测序。根据已获得的全部cDN段，设计引物YB－ORF－F和YB－ORF－R扩增YB基因的开放读码框。

4序列分析

在NCBI网站，进行相似性搜索，下载其他物种冷休克Y－box蛋白的序列。通过ORFFinder找到红螯螯虾冷休克Y－boxcDNA序列的开放读码框，并推导出其氨基酸序列，用ComputepI/Mw和Interproscan等工具分别预测相对分子质量、等电点和功能域，用ClustalW同源性分析，用MEGA软件构建系统进化树，冷休克Y－box蛋白的三级结构预测用SWISS－MODEL。

5Real－timePCR分析

使用Trizol分别提取3尾红螯螯虾肝脏、肠、鳃、心脏、血淋巴、神经和肌肉总RNA，以OligodT和随机引物合成cDNA第一链，根据已获得的红螯螯虾的冷休克YB基因全长序列设计引物YB－RT－F和YB－RT－R，同时以红螯螯虾β－actin基因序列(GenBank:AY430093)为内参设计引物β－actin－F和β－actin－R，对各组织冷休克YB基因的表达进行定量分析，扩增条件同为94℃预变性30s后，94℃5s、60℃30s进行40个循环。PCR结束后对扩增产物进行溶解曲线分析，以确保特异性扩增。每个样品设3个重复，以未加模板的PCR反应样品作为阴性对照。不同组织中的冷休克YB基因相对表达水平用2－△△CT方法(△△Ct=(Ct目的基因－Ct管家基因)实验组－(Ct目的基因－Ct管家基因)对照)进行计算，数据分析采用t测验方法(SPSS软件)，当P＜0.05时被判定为差异显著。

结果

1红螯螯虾冷休克Y－box蛋白基因的克隆和氨基酸序列分析

红螯螯虾的冷休克YB基因全长cDNA由1733bp组成，其编码区有975bp，编码324个氨基酸。在起始密码子ATG的上游有82bp非翻译区，终止密码子TAA的下游有包含polyA在内的676bp非编码区序列(图1A)。红螯螯虾冷休克Y－box蛋白的预测等电点和相对分子质量分别为9.81和35800。

2红螯螯虾冷休克Y－box蛋白氨基酸序列比对和系统进化分析

通过序列比对和相似性分析，红螯螯虾冷休克与其他物种的冷休克Y－box蛋白有一定的相似性，特别是在前部(20－98AA，冷休克结构域)具有非常高的相似性，此部分为此类蛋白重要的功能域(冷休克蛋白保守位点和核酸集合功能域)(图2)，而其他部分(富含丙氨酸或脯氨酸的区域、带电荷区域，图1B)的相似性较低。通过ClustalW软件分析和MEGA软件构建冷休克Y－box蛋白的系统进化树，红螯螯虾冷休克Y－box蛋白与水蚤的冷休克Y－box蛋白进化关系最近，并与昆虫等其他节肢动物冷休克Y－box蛋白聚为一支(图3A)，而与脊椎动物冷休克Y－box蛋白序列(同样聚为一支)进化关系相距较远。应用SWISS－MODEL预测了红螯螯虾冷休克Y－box蛋白的三级结构，并与D.pulex冷休克Y－box蛋白的三级结构进行对比，发现它们的结构非常相似(图3B和C)。

3红螯螯虾冷休克Y－box蛋白基因的组织表达分析

使用Realtime－RT－PCR方法对红螯螯虾冷休克Y－box蛋白基因在各组织中的转录情况进行研究，结果显示，冷休克Y－box蛋白基因转录活性最强的组织是神经，而后依次为肝脏、血淋巴和鳃，在肠和心脏中也有活性，在肌肉组织中转录保持较低水平(图4)。

讨论

本研究克隆的红螯螯虾冷休克Y－box蛋白基因cDNA开放读码框为975bp，推测的蛋白质324个氨基酸。与其他冷休克Y－box蛋白一样，红螯螯虾冷休克Y－box蛋白也由三部分结构域组成(富含丙氨酸或脯氨酸的区域、冷休克结构域和带电荷区域)，其中20－98AA为冷休克结构域，此部分具有很高的保守性，与脊椎动物(哺乳动物、鸟类、鱼类等)和其他无脊椎动物(软体动物、昆虫等)的相似性都在80%以上。因此，作为第一个发现的经济水生甲壳动物的冷休克Y－box蛋白，其具有与其他动物冷休克Y－box蛋白相似的特征。通过冷休克Y－box蛋白氨基酸序列遗传进化分析，发现红螯螯虾与另外一个甲壳动物———水蚤的进化关系最近，且与昆虫等节肢动物聚为一支，而其他脊椎动物、软体动物等聚为一支，这也基本上与传统的动物系统发生分类次序吻合。本研究还预测了红螯螯虾冷休克Y－box蛋白的三级结构，发现其三级结构与其他动物冷休克Y－box蛋白的三级结构非常相似，特别是冷休克结构域部分都是由六个相同的β－折叠组成，只是在蛋白的N端有一部分结构有差别。由于目前发现的冷休克Y－box蛋白较少，且报道的相关研究对象都是人、鼠等模式动物。而本研究中发现的冷休克Y－box蛋白来源于甲壳动物。无脊椎动物和脊椎动物在器官分类上有较大的差别，加之有关无脊椎动物冷休克Y－box蛋白基因组织分布也未见报道，所以目前只能对不同的动物种类冷休克Y－box蛋白基因的组织分布做直观描述，无法进行不同物种之间相关信息的对比。研究了红螯螯虾冷休克Y－box蛋白在不同组织中的分布，发现红螯螯虾冷休克Y－box蛋白基因转录活性最强的组织是神经，这可能与在对冷刺激敏感相关，也可能与神经在信号传导和内分泌调剂中的重要作用相关［18－20］，红螯螯虾冷休克Y－box蛋白基因在心、肠和肌肉中的表达量很低。在非洲爪蟾中，卵巢和睾丸中冷休克Y－box蛋白基因转录活性最强，而后依次是输卵管、肾、心、肝和皮肤［21］。在小鼠中也是睾丸中冷休克Y－box蛋白基因转录活性最高，而后其次是肌肉、肾、脾、心和卵巢，肝和血中几乎没有表达［18］，还有人发现小鼠冷休克Y－box蛋白基因转录活性的顺序为睾丸、肾、心、脾、肌肉、肝和脑［22］，以上证明冷休克Y－box蛋白在动物睾丸中表达最高，表明其在精子发育中起到非常重要的作用［18，21－22］。由此看出冷休克Y－box蛋白基因在不同动物心和肌肉中的表达量均较低，而在与内分泌相关的组织如卵巢、睾丸等中表达量较高。然而，此前关于Y－box蛋白在其他动物组织中的分布情况研究都没有涉及神经组织，所以本研究为其他动物Y－box蛋白在组织中的分布研究提供了新的思路，即除了关注肌肉、肾、脾、心、肝和生殖系统的组织外还需要关注神经组织，也许神经组织在这些动物中也是Y－box蛋白的高表达区，而与神经相关联的内分泌系统可能在参与冷休克蛋白的功能表达和信息传递中起重要作用。本研究首次克隆的到了红螯螯虾冷休克Y－box蛋白基因，对其组织表达进行了研究，并发现该蛋白在神经中的高表达现象，为下一步深入开展该蛋白的功能及其与其相关的生理调节机能研究奠定了基础。