本文作者：孙占斌1袁行方1王音娴1张辉2张文会2冯永君1

作者单位：1.北京理工大学生命学院2.聊城大学生命科学学院

植物内生菌能定殖在健康植物组织内并与植物建立和谐联合关系,它们能通过产生IAA、细胞激动素等物质,促进植物生长发育;还可通过产生抗生素、生物碱类物质与病原菌竞争生态位等起到对植物的保护作用[1],甚至能够诱导植物产生系统抗性来增强宿主的生存适应性[2]。植物-内生菌这种和谐共生、互利共栖的生命形式,是“资源节约型,环境友好型”生态型农业发展的一条重要思路。

黄瓜是世界上分布最广泛、最重要的蔬菜栽培作物之一,在我国蔬菜周年供应中同样占有极其重要的地位。据联合国粮农组织统计,2004年我国黄瓜栽培面积已达1502900hm2,产量达到25558000Mt[3]。黄瓜生长周期主要包括营养和生殖生长两个阶段。前者包括发芽和幼苗期;后者包括初花和结瓜期,该阶段占据了大部分生育期且与产量形成密切相关。影响初花和结瓜期的因素除了环境因素(如温度、光照、水分),还有生物因素如植物自身分泌的激素及内生菌的影响等[4]。由于植物与内生菌的作用是相互的,因此由于植物生长发育阶段更替带来的生理生化变化,必然会影响到定殖微生物的种群与数量等[5],相关研究对从微生态角度研究作物生长、产量形成具有重要意义,备受关注。目前国内外关于黄瓜内生菌的研究相对较少,且主要集中在内生真菌和放线菌方面,其研究目的也主要是在抗病与促生方面[6],关于黄瓜内生细菌的多样性研究尚未见报到。本文则主要探索黄瓜初花和结瓜期内叶片可培养内生细菌的种类、数量及优势菌的种类变化,为黄瓜促生内生细菌的理论探索和生产应用提供一定的研究基础。

1材料和方法

1.1黄瓜品种与植株

黄瓜为“中农16”品种,由中国农业科学院蔬菜花卉研究所研制,抗多种病害,为目前华北地区瓜农种植主栽品种。黄瓜植株,于2010年4月中旬至5月中旬分3次采自北京市平谷区农业推广学校蔬菜大棚。取样阶段为初花期和结瓜期,试验对象为植株叶片。

1.2内生菌的分离与培养

分别取初花和结瓜期的黄瓜植株叶片各1g,用无菌水冲洗干净,无菌滤纸吸干后,分别用75%酒精浸泡2min,2.6%NaClO浸泡5min,75%酒精浸泡1min进行表面消毒,再用无菌水冲6次,将最后一次冲洗液涂营养琼脂(NA)培养基(g/L):牛肉膏3,蛋白胨10,氯化钠5,琼脂1820,pH6.87.0,1105Pa高压蒸汽灭菌20min。平板检查表面消毒效果,要求对照平板无菌落生长,确保表面消毒彻底。将消毒后的样品放在加有9mL无菌水的无菌研钵充分研磨,静置20min,再稀释3个浓度梯度,各取0.1mL涂布到NA培养基中,每个梯度3个重复,置于恒温培养箱中30°C培养13d。每个叶片样品做3个重复。

1.3内生菌的纯化与保存

细菌培养13d后分别记录各平板的菌落数量,根据菌落形态(大小、形状、颜色、表面光泽度、边缘整齐度、透明度和质地等),镜检菌体形态(形状、革兰氏染色反应、排列方式和有无芽孢等);分别挑取有差异的菌落,在NA平板上划线纯化3次,将纯化后的内生细菌编号后接种到相应培养基斜面上4°C冰箱保存,同时采用80°C甘油管冻存。

1.4内生细菌DNA模板的提取与16SrDN段扩增

将内生细菌培养至指数期,取1.5mL菌液用基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取基因组DNA,进行16SrDNA序列扩增。扩增选用通用引物[7],由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：P1:27f(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3),P2:1492r(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)。PCR扩增时,94°C4min;94°C1min,55°C1min,72°C2min,共30个循环;72°C10min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5细菌16SrDNA序列测定与同源性比对

PCR扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序后,用CHECK-CHIMERA进行嵌合体序列的鉴定,除去嵌合体及怪异序列,再与GenBank数据库中的已知序列进行NCBIBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对分析,寻找具有较高同源性的16SrDNA序列。确定各菌株有效序列后用ClustalX进行多序列比对[8],再用Megaversion4.1进行系统发育分析,其中系统进化矩阵按Kimura2-Parameter模型计估算[9],采用邻接法(Neighbor-Joining)聚类分析[10],构建系统发育树。重复取样1000次进行自展值(Bootstrapvalue)分析评估系统进化树的拓扑结构的稳定。

根据文献,定义16SrDNA序列相似性大于98%归于同一个物种[11]。

2结果与分析

2.1初花期和结瓜期黄瓜叶片内生菌的分离

将初花和结瓜期两时期的黄瓜叶片表面消毒后,进行组织内生细菌的分离培养,结果表明,在NA平板上长出大量菌落,菌落形态存在明显差异,说明黄瓜叶片中不仅存在大量内生细菌,且种类丰富。菌落计数得到两时期内生菌数量分别为:初花期为(2.6±0.18)106CFU/g鲜重,结瓜期为(5.2±0.42)105CFU/g鲜重(显著性水平P＜0.05),前者是后者的5倍。选择差异明显的菌落进行平板划线纯化,共得到81株内生菌;其中,初花期38株,结瓜期43株。

2.216SrDNA序列扩增及菌种鉴定

将两个时期分离的81株内生细菌成功提取基因组DNA,对其16SrDNA序列进行PCR扩增均得到片段约1.5kb的单一条带(图1,图中仅列出两个时期部分内生菌的电泳条带,其它菌的条带位置与图中一致)。将PCR产物测序并将测得的序列提交登陆GenBank并获得登录号(JN084129-JN084164,HQ874629)。

2.3系统发育分析

对上述初花期的38株和结瓜期的43株内生细菌的16SrDNA序列进行比对分析,结果见表1和2以及图2和4。从分析结果(表1和图2)看,初花期的38株内生细菌分别属于4个细菌类群中的14个已知属。其中放线菌类(Actinobacteria)最多,占60.5%,为优势菌群,包含7属。其次是厚壁菌类(Firmicutes),占28.9%,包含2属。剩余的两类：伽马变形杆菌类(Gammaproteobacteria)和阿尔法变形杆菌类(Alphaproteobacteria)各占7.9%和2.7%,分别包含2属和1属(图3A)。其中,短小杆菌属(Curtobacterium)含有7株细菌,在初花期为优势属,其次是芽孢杆菌属(Bacillus),含有6株细菌。其中,隶属于短小杆菌属的菌株Y1为最优势种,占初花期分离内生菌总量(以CFU计)的57.6%。此外,隶属于藤黄单胞菌属(Luteimonas)的一株编号Y4的内生菌与已知序列同源性为96.8%,通过分子生物学及生理生化指标测定确定其为一新种,将在近期另文发表。需要指出的是,鉴于优势种在所有分离菌的比例仅是依据形态学特征来区分和计算的,其统计数量和比例仅供参考之用。

从表2和图4可以看出,结瓜期的43株内生细菌分别属于5个细菌类群中的11个已知属。其中伽马变形杆菌类细菌最多,占46.5%,为优势菌群,包含3属。其次是阿尔法变形杆菌类,占23.3%,包含2属,放线菌类和厚壁菌类占有相同的比例13.9%,分别包含3属和2属。异常球菌类(Deinococci)含量最少,为2.4%,仅含有1属(图3B)。其中,泛菌属(Pantoea)含有15株细菌,是结瓜期的优势菌属,其次是农杆菌属(Aqrobacterium),含有9株细菌。其中,隶属于泛菌属的菌株CE1为最优势种,占结瓜期分离内生菌总量(以CFU计)的65.0%。

3讨论

植物内生菌的分离鉴定是内生菌研究的首要问题,是内生菌与植物的互作研究、发现重要功效内生菌的前提,一直受到高度重视。本文选用在我国蔬菜种植中占有重要地位的黄瓜“

中农16”品种为研究对象,探究初花期和结瓜期叶片内生菌的多样性,并对这些内生菌进行了16SrDNA鉴定。两时期共分离到内生菌81株,初花期38株,分属于14个已知属,其中隶属于短小杆菌属的菌株Y1为最优势种,占57.6%,发现Y4菌株属于新种Luteimonassp.。结瓜期43株分属于11个已知属,其中隶属于泛菌属的菌株CE1为最优势种,占65.0%。显示出两个时期黄瓜叶片组织内生菌的多样性。

内生菌数量方面,初花期内生菌含量是结瓜期的近5倍,体现出不同生育期内生菌数量的显著差异。这种变化可能与植物不同生长期的生理生化变化有关,或由于内生菌群之间出现竞争导致种类和数量发生变化。初花期的某些内生菌群可能与茎叶的形成、根系的发展和花的开放相关;结瓜期的某些内生菌群可能与结瓜期果实的发育成熟有关。因此,了解生殖生长期内生菌多样性及动态变化,对于研究内生菌群和产量的关系十分重要。这种在不同生长时期,植物内生菌的种类和数量会发生变化的现象也在其它一些植物中发现。McInroy报道,棉花内生菌数量在不同生育期存在明显差异：从苗期开始增加,到成株期达到最大,然后到成熟期又开始下降[12]。此外,在水稻[5]、番茄[13]、豆科植物[14]和花生[15]中也发现此类现象。

本研究显示,黄瓜叶片内生菌种类丰富,表现出很强的多样性,其中很多很可能具有一定的应用价值。结瓜期的优势菌株CE1,占分离内生菌数量的65.0%,与其同源性最高的成团泛菌具有潜在的促生作用,例如我们前期研究发现与CE1同源性较高的成团泛菌YS19是水稻优势菌群,它可以通过固氮或产生四种植物激素来促进水稻的生长[16]。有些则与抗病相关,与Y22菌株同源的苏云金芽孢杆菌有杀虫作用[17];与CE42菌株同源的多粘类芽孢杆菌有很高的杀菌抗病活性[18]。还有一些在环境治理修复方面具有重要的应用价值,比如与Y20菌株同源的裂解烃微杆菌,与Y37菌株同源的藤黄微球菌,与CE27菌株同源的简单芽孢杆菌等[1920]。在初花期占分离菌总数的57.6%的优势种Y1菌株,与其同源性最近的海洋短小杆菌在应用价值方面目前缺乏相关报道。本研究所获得的内生菌在与黄瓜互作中的生物学效应,以及潜在的环境应用价值等都值得进一步研究。