本文作者：王彦、孟祥晨、王丽群、李馨单位：东北农业大学乳品科学教育部重点试验室

双歧杆菌是人和动物肠道最常见的革兰氏阳性有益细菌,约占人体肠道可培养微生物的10%。双歧杆菌属的微生物是应用较多的益生菌之一,在食品中通常通过添加于乳制品进行食用消费。研究表明,双歧杆菌可以通过平衡肠道菌群维持机体的整体健康水平。双歧杆菌经食用进入体内,发挥益生功能的先决条件是其在肠道的黏附与定植,例如黏附能够缩短痢疾持续时间[1],刺激免疫应答[23],竞争排斥病原微生物[4]等,因此,黏附肠道能力是筛选益生菌的一个重要标准。双歧杆菌被摄食后,在未达到肠道前会经历胃的酸性环境,而人体胃液的酸度很强,通常的pH为3.0,空腹或食用酸性食品时可达1.5,食用碱性食物时可达4.05.0[5],双歧杆菌经历该酸性环境后,其黏附作用会受何影响还不清楚。因此,本文将主要探讨不同pH的酸性环境对双歧杆菌黏附能力的影响。由于体内实验实施困难,体外细胞培养,尤其是人结肠癌细胞系Caco-2细胞,可作为模型用于分析菌株的黏附[67]。另外,有研究表明双歧杆菌的黏附能力与细菌表面组成及结构直接相关,所以菌体表面的物理化学性质也可以间接反应菌体的黏附能力,菌体细胞表面的物理化学特征主要取决于其表面疏水性和自动聚集能力,Pan等[8]通过对23株双歧杆菌疏水性和黏附能力进行比较分析,建立了能够反映双歧杆菌表面疏水性与黏附性之间关系的回归方程(R2=0.78),疏水性越强的菌株黏附能力越强。王丽群等[9]测定了7株双歧杆菌表面疏水性和自动聚集能力,同时观察了双歧杆菌的黏附能力,结果表明,双歧杆菌的黏附能力、自动聚集能力及表面疏水性具有一定的正相关性。因此,在评价低pH处理对菌株黏附性影响时,本研究同时确定对菌体自动聚集能力和表面疏水性的影响。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌种:两歧双歧杆菌KLDS2.0603分离自成人粪便,由乳品科学教育部重点实验室冻干保藏。

1.1.2供试细胞:Caco-2(Humancolonadenocar-cinoma,人结肠腺癌细胞),其特征是能够体外模拟成熟上皮细胞的结构和功能特征,购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养:从液氮罐中取出Caco-2细胞,将冻存管迅速置于37°C水浴中复苏细胞,离心收集细胞后,加入4mL含10%胎牛血清(使用前56°C灭活30min)的DMEM培养基,在37°C、5%CO295%空气的条件下培养,每隔一天更换培养液;当细胞在培养瓶底长至80%时,需进行传代。用于黏附测定的Caco-2细胞,单层细胞培养于预先放有玻璃盖玻片的六孔培养皿,接种量为1×105CFU/mL,每隔48h及进行黏附试验前24h更换一次培养基,维持细胞生长。单层细胞培养1517d,后期融合后,即可用于黏附试验。

1.2.2菌种的活化与传代:两歧双歧杆菌KLDS2.0603接入mMRS液体培养基,37°C条件下厌氧(80%N2、10%H2、10%CO2,下同)培养48h;在mMRS固体培养基上划线,37°C条件下厌氧培养48h,镜检后挑取固体培养基中形态良好,没有杂菌的菌落,接入mMRS液体培养基中,37°C条件下厌氧培养48h,经过两代液体培养以提高菌株活力。

1.2.3双歧杆菌经不同pH的PBS溶液处理后存活率的测定:将生长至对数生长期后期的细菌培养物8000g离心10min,收集菌体,菌体经PBS(pH7.2)清洗两遍后重悬于pH为1.03.0(以0.5为梯度)的PBS中,37°C分别孵育0.5、1.0、1.5和2.0h,然后采用平板计数法测定其活菌数,分别计为An,经PBS处理前的活菌数计为A0,存活率(%)表示为:An-1/A0×100。同时以pH为7.0的PBS处理作对照。确定存活率变化最大的时间点为处理时间。

1.2.4不同pH的PBS溶液对双歧杆菌的处理:将生长至对数生长期后期的细菌培养物8000g离心10min,收集菌体,菌体经PBS(pH7.2)清洗两遍后重悬于pH为1.05.0(以0.5为梯度)的PBS中于37°C处理0.5h,8000g离心10min,收集菌体,经PBS(pH7.2)清洗两遍后,收集菌体,再进行后续实验。同时以pH为7.0的PBS处理作对照。1.2.5双歧杆菌黏附性的测定:(1)直接镜检法测定双歧杆菌的黏附能力。参考Gopal等[10]的方法,采用直接镜检法测定双歧杆菌的黏附能力,具体步骤如下:将菌体浓度调整为1×108个细胞/mL,经PBS溶液处理后重悬于DMEM培养基,用于黏附测定。Caco-2细胞用PBS(pH7.2)清洗后,添加2mL含双歧杆菌的DMEM培养基,于37°C、5%CO2-95%空气条件下孵育1h。单层细胞用无菌PBS缓冲液清洗5次,甲醇固定10min,革兰氏染色,在显微镜油镜下观察细菌与细胞的黏附状态。黏附能力以随机选取的20个显微视野进行评价,并以100个Caco-2细胞黏附的细菌数表示。(2)平板菌落计数法测定双歧杆菌的黏附率。参考Kos等[11]的方法,采用平板菌落计数法测定双歧杆菌的黏附能力,具体步骤如下:将菌体浓度调整为1×108个细胞/mL,经PBS溶液处理后重悬于DMEM培养基,用于黏附测定。Caco-2细胞用PBS(pH7.2)清洗后,添加2mL含双歧杆菌的DMEM培养基,37°C、5%CO2-95%空气条件下,培养1h。单层细胞用无菌PBS(pH7.2)缓冲液清洗5次,以除去未黏附的细菌细胞,加入250μLTrypsine-EDTA(0.05%Tryp-sine,0.53mmol/LEDTA)于37°C培养15min,将黏附的细菌从细胞上释放下来。然后向每个孔中添加250μL含10%胎牛血清的DMEM以终止胰酶活力,用吸管将Caco-2细胞层裂解下来。黏附细菌经10倍系列稀释后涂布于mMRS平板,做平行对照,37°C厌氧培养,活菌数计为A1,黏附前的活菌数计为A0。黏附率(%)表示为:A1/A0×100。

1.2.6双歧杆菌疏水性的测定:通过实验菌株对碳氢化合物的亲和力反映菌株表面疏水性,具体参考Rosenberg等[12]的方法,步骤如下:将PBS溶液处理后的菌体,用PBS缓冲液在600nm处调节吸光值为0.80.9(准确读取其吸光度值,记作A0)。取3mL该菌液,然后加入0.6mL十六烷。该两相体系通过涡旋振荡彻底混合2min,37°C共孵育1h后去除上清液,于600nm处测定水相的吸光值(记作A)。按如下公式计算实验菌株的疏水性[H(%)]:H(%)=[(A0A)/A0]×100,这里A0和A分别表示有机溶剂萃取前后的吸光值。进行3次独立的试验。

1.2.7双歧杆菌自动聚集能力的测定:菌株的自动聚集能力以自动聚集百分比表示,具体参考Collado等[13]的方法,方法如下:将PBS溶液处理后的菌体重悬于耗尽的mMRS培养基中,经漩涡振荡2min后,取1mL测定细菌悬浮液在600nm处的吸光值作为整个细菌悬浮液的吸光值,而后25°C静止放置120min后,取1mL上层清液至另一试管中,在600nm处测其吸光值,通过以下公式计算自动聚集百分比:1(上层清液吸光值/整个细菌悬浮液吸光值)×100。

1.3数据处理所有实验均重复3次,运用SPSSStatisticsV17.0软件,采用独立样本t检验进行数据分析(P<0.05),试验结果用平均值±标准偏差表示。

2结果与分析

2.1不同pH的PBS溶液处理后双歧杆菌的存活率两歧双歧杆菌KLDS2.0603经不同pH的PBS溶液处理不同时间后,分别测定其存活率,结果见图。由图1可知:两歧双歧杆菌KLDS2.0603在pH为1.0和1.5的PBS中处理0.5h后,已经无法检测到活菌;在pH为2.0的PBS中处理0.5h后,活菌数仅为6.85×104CFU/mL,并随处理时间的延长活菌数逐渐下降,处理1.5h后几乎检测不到活菌;在pH为2.5的PBS溶液中处理0.5h后存活率为52.35%,并随处理时间的延长活菌数逐渐下降;在pH3.0的PBS溶液中,在处理的2.0h内,活菌数并无明显变化。综合上述结果,确定两歧双歧杆菌KLDS2.0603在不同pH的PBS溶液中的处理时间为0.5h时存活率变化最大。

2.2不同pH的PBS溶液处理对双歧杆菌黏附性的影响

2.2.1采用直接镜检法获得的结果:采用直接镜检法测定经不同pH的PBS溶液处理后,两歧双歧杆菌KLDS2.0603的黏附能力,结果如图2所示。由图2可知:两歧双歧杆菌KLDS2.0603在pH7.0时的黏附性为260.90个/100个细胞;除pH5.0的处理组外,其余各组的黏附性均显著低于对照组(P<0.05);pH1.5(黏附性为119.05个/100个细胞)和pH2.5(黏附性为111.02个/100个细胞)两处理组的黏附能力最低,且显著低于其余各处理组(P<0.05)。由图1的结果可知:在pH为1.0和1.5条件下处理0.5h后,已经检测不到活菌,但此时仍有细菌黏附,说明死菌体也具有一定的黏附能力。

2.2.2采用平板菌落计数法获得的结果:由于直接镜检法无法区分黏附的死菌体和活菌体,因此采用平板菌落计数法测定黏附的活菌体数量。图3给出的是经不同pH的PBS溶液处理后,两歧双歧杆菌KLDS2.0603的黏附能力。由图3可知:对照处理组(pH7.0)的黏附率最大,除pH5.0的处理组外,其余各处理组的黏附率均显著低于对照组(P<0.05)。在pH为1.02.0的范围内未检测到活菌,其黏附率为0;在pH为2.53.5的范围内,随pH升高,黏附率下降;在pH为4.05.0的范围内,随pH升高,黏附率逐渐升高。

2.3不同pH的PBS溶液处理对双歧杆菌疏水性的影响图4是两歧双歧杆菌KLDS2.0603经不同pH的PBS溶液处理后的表面疏水性。由图4可知:两歧双歧杆菌KLDS2.0603在pH7.0时的疏水性为77.16%;pH3.0(疏水性为88.69%)和pH3.5(疏水性为89.84%)两处理组的疏水性显著高于对照组(P<0.05),其余处理组与对照组无显著差异。2.4不同pH的PBS溶液处理对双歧杆菌自动聚集能力的影响图5是两歧双歧杆菌KLDS2.0603经不同pH的PBS溶液处理后的自动聚集能力。由图5可知:除pH1.0、1.5和5.0处理组外,其余各组均显著低于对照组(pH7.0);在pH为1.03.0范围内,随pH的升高,自动聚集能力逐渐降低;在pH为3.55.0范围内,随pH的升高,自动聚集能力逐渐升高。

3讨论

由于益生菌到达人体肠道发挥益生作用前,会经历胃酸等酸性环境[5],较低的酸性环境会对益生菌的存活造成一定影响,已有的研究表明[1415],双歧杆菌的耐酸性具有种属特异性,不同双歧杆菌的胁迫致死pH不同。Liu等[16]用pH2.0的PBS来测定38株双歧杆菌的存活率,发现处理90min时几乎无存活,由本试验可以看出当pH降低到3.0以下时,会对双歧杆菌的存活造成显著影响(图1)。这些酸性环境也可能会进一步影响益生菌在人体内的定植和其益生作用的发挥。本试验以高黏附能力菌株两歧双歧杆菌KLDS2.0603为研究对象,针对不同pH的酸性环境对两歧双歧杆菌KLDS2.0603黏附的影响进行研究,以Caco-2细胞为模型,采用平板菌落计数法和直接镜检法对双歧杆菌的黏附能力进行测定。结果表明,经不同pH酸处理后的两歧双歧杆菌KLDS2.0603黏附能力下降。经非致死的酸性条件处理后,随pH的增加,两歧双歧杆菌KLDS2.0603黏附能力逐渐升高(图2、3)。经致死酸性条件处理后,黏附率有所下降,可能由活菌数下降所导致(图2),同时实验证实,酸处理的致死菌株也具有一定的黏附能力(图3)。本研究证实酸性环境影响了实验菌株的黏附性,这种影响是不利的。许多报道指出,黏附是一个复杂的多步的过程,黏附过程分为非特异性结合阶段和特异性黏附阶段,非特异性结合是益生菌与细胞的黏附过程中乳酸菌产生的胞外多糖(EPS)起作用[17];特异性结合是黏附素与黏附素受体之间的特异性结合,有研究表明益生菌的膜蛋白和脂磷壁酸(LTA)介导乳酸菌与肠上皮细胞的特异性黏附[3,1819]。益生菌在低pH处理后膜脂质会发生相应变化[20],同时产生相应的酸应激蛋白[21],可能会使菌体表面的黏附素发生变化,从而降低了菌体的黏附作用。此外,疏水作用被认为是影响细菌与宿主间反应的因素之一,与多种黏附现象,如组织表面的黏附、塑料表面的黏附、细菌间的集聚等均有关。细菌的疏水性源于菌体表面静电荷、极性和非极性残基的相对分布。双歧杆菌表面疏水性和自动聚集能力通常被认为是两个独立的、能够反映双歧杆菌黏附能力的特征[22]。本研究同时对双歧杆菌表面疏水性和自动聚集能力进行测定,分析酸处理后双歧杆菌表面性质和黏附能力之间的相关性。研究证实,除pH为3.5处理组外,两歧双歧杆菌KLDS2.0603的表面疏水性和黏附能力呈现很好的正相关性;除pH3.0的处理组外,两歧双歧杆菌KLDS2.0603的自动聚集能力和黏附能力呈现较好的正相关性。对于pH为3.0和3.5处理组所呈现的非正相关性,分析原因可能在于pH3.0和3.5是致死pH向非致死pH的过度,pH对菌体表面静电荷的影响不同,或不同程度上改变了菌体表面极性和非极性残基的相对分布,但这些因素的改变是否是引起黏附能力改变的主要因素,还有待进一步的证实。